從生物體內取出組織或細胞，在體外(in vitro)模擬體內生理環(huán)境，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，對這些組織或細胞進行孵育培養(yǎng)，可使之保持一定的結構和功能，以便于我們觀察研究，這種技術就是細胞培養(yǎng)（cell culture）。細胞培養(yǎng)有時也稱為組織培養(yǎng)（tissue culture），二者可作為同義語使用。細胞培養(yǎng)的工作始于20世紀初，目前廣泛應用于生物學、醫(yī)學的各個領域，是各種細胞工程技術的重要基礎。

根據細胞的來源我們可以將其分為原代細胞與細胞系，他們的獲取與持續(xù)培養(yǎng)包括原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，今天就來給大家介紹原代細胞與細胞系是怎樣進行培養(yǎng)的。

原代細胞與細胞系

原代細胞

原代細胞（primary culture cell）指的是從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞。一般把培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內的細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。原代細胞廣泛應用于分子、細胞生物學和生物醫(yī)學基礎研究，如蛋白質組學、基因組學、細胞株（系）研究、DNA，RNA和遺傳學研究等，此外在當今熱門的生物醫(yī)藥產業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究面也至關重要。因其最接近和最能反映體內生長特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實驗研究，所以在生物醫(yī)藥領域有不可替代性作用，市場前景廣闊。

細胞系

細胞系(cell line)指原代細胞培養(yǎng)物經首次傳代成功后所繁殖的細胞群體，也指可長期連續(xù)傳代的培養(yǎng)細胞。(由此便引申出了后來的有限細胞系(Finite CellLine)、無限細胞系(Infinite CellLine))，因此，細胞系狹義上是指可連續(xù)傳代的細胞(特定環(huán)境下口語和書面語都使用)，廣義上是指可傳代的細胞。1951年從海瑞塔·拉克斯的宮頸癌組織分離的細胞--Hela細胞是歷史最久、應用最廣泛的細胞系。

原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，是從供體取得組織細胞在體外進行的首次培養(yǎng)，是建立細胞系的第一步，也是一項基本技術。在原代培養(yǎng)中，將動物機體的各種組織取出，經各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，在合適的培養(yǎng)基和環(huán)境下培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖。因此，嚴格說來是，原代培養(yǎng)是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細胞保持原有細胞的基本性質，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數。但實際上，我們通常把第一代至第十代以內的細胞培養(yǎng)統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。

最常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)、消化培養(yǎng)法、分散細胞培養(yǎng)和器官培養(yǎng)法。

注：此處的原代培養(yǎng)試劑是指初代培養(yǎng)，即原代細胞在傳代成功前的培養(yǎng)

　① 組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。其基本方法是將剪成的小組織團塊接種于培養(yǎng)瓶(或皿)中，瓶壁可預先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細胞能沿瓶壁向外生長。

　② 消化培養(yǎng)法

此法進行原代細胞培養(yǎng)時，首先需要將組織樣本取出，去除其中血管和結締組織，然后將其切成小塊。接著將組織塊放入酶消化液中，進行消化。消化時間的長短取決于組織的種類和大小，一般需要在37℃下進行1-2小時。消化結束后，將消化液離心，去除上清液，留下細胞沉淀。細胞沉淀可以用細胞培養(yǎng)基進行洗滌，去除殘留的酶消化液和細胞碎片。最后將細胞沉淀轉移到培養(yǎng)皿中，加入適量的細胞培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)

?、?懸浮細胞培養(yǎng)法

對于懸浮生長的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經淋巴細胞分層液分離后接種培養(yǎng)。

?、芷鞴倥囵B(yǎng)

器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性，可用于重點觀察細胞間的聯系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調節(jié)作用。

傳代培養(yǎng)

體外培養(yǎng)的原代細胞或細胞系要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細胞株或得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉移到另外的容器中進行培養(yǎng)，此即為傳代培養(yǎng)。

細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細胞世代或倍增不同。在一代中，細胞培增3～6次。細胞傳代后，一般經過三個階段：游離期、指數增生期和停止期。常用細胞分裂指數表示細胞增殖的旺盛程度，即細胞群的分裂相數／100個細胞。一般細胞分裂指數介于0.2％～0.5％，腫瘤細胞可達3～5％。細胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好時期，稱指數增生期(對數生長期)，適宜進行各種試驗。

依據細胞生長的特點，傳代方法有3種：

①懸浮生長細胞傳代（離心法）

將懸浮細胞離心（1000 rpm， 3 min）去上清，收集沉淀物加新培養(yǎng)基，混勻后進行傳代培養(yǎng)。

②半懸浮生長細胞傳代（直接吹打法）

此類細胞（如Hela細胞）部分貼壁，但黏貼不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁上脫落下來，進行傳代。

③ 貼壁生長細胞傳代（酶消化法）

去除培養(yǎng)容器內培養(yǎng)液后，加入1-2ml 0.25%的胰蛋白酶液（以消化液覆蓋整個瓶底為準）37℃靜置2-10min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。移去蛋白酶液，加入培養(yǎng)液反復吹打瓶壁細胞，離心將細胞沉淀用培養(yǎng)液制成細胞懸液。吸取1/10—1/40細胞懸液，接種于含有適量新鮮培養(yǎng)液的新培養(yǎng)瓶中進行傳代培養(yǎng)。

注：細胞接種數要達到5×104~8×105個/ml，傳代密度太低時，細胞容易死亡，在達到增殖期前有較長的滯留期；培養(yǎng)液由pH下降而呈黃色時，細胞已達最大密度而需要換液或傳代；單層貼壁細胞，等長滿培養(yǎng)瓶表面時，即可傳代；吹打細胞時，動作要輕柔緩慢，減少對細胞的機械損傷；傳代時細胞接種數量要多；培養(yǎng)基的pH要低些；首次傳代時，小牛血清濃度可加大至15%~20%。

通過上面介紹我們發(fā)現原代細胞培養(yǎng)其實可以分為出初代培養(yǎng)（獲得原代細胞）和傳代培養(yǎng)（延續(xù)原代細胞）兩部分，那如何獲得原代細胞呢，接下來我們以新生大鼠原代心肌細胞和人PBMC細胞為例分別介紹貼壁細胞和懸浮細胞的初代培養(yǎng)：

新生大鼠原代心肌細胞制備

1960年，haray等首次對乳鼠心肌細胞進行培養(yǎng)，體外培養(yǎng)的心肌細胞在生長、發(fā)育、生理、代謝、病理等研究中具有重要意義。

1.手持大鼠乳鼠（出生1-3d），以75%乙醇消毒皮膚，沿胸骨打開胸部，用彎鑷提取心臟，至于盛有PBS的100mm大皿中；

注：新生大鼠心肌細胞在出生后3d內具有部分增殖能力，成年大鼠心肌細胞則為終末分化細胞，不再具有分裂增殖能力。

2. 將心臟表面附著的大血管剪去，剪去心房，放入5ml離心管中充分剪碎成肉泥狀；

3.加入3ml左右膠原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹勻，37℃消化8min，自然沉淀，棄上清，再加3ml左右膠原酶和1.5ml 0.05%胰酶，充分吹勻，37℃消化10mim

注：胰蛋白酶膠原酶混合使用（0.4%膠原酶：0.05%胰酶=2:1）。組織細胞由紅轉半透明時，停止消化

4.取上清，3000rpm 離心5min，鋪中皿含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，剩余沉淀中加入3ml膠原酶和1.5ml 0.05%胰酶，充分吹勻后37℃繼續(xù)消化5min；

5.重復4的步驟直至組織塊消化完畢；

6.培養(yǎng)箱2-3h待成纖維細胞貼壁后輕輕吹打培養(yǎng)基，所有中皿上清移入離心管3000rpm離心5min，棄上清，加入10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基以及Brdu，鋪中皿培養(yǎng)。

注：溴脫氧尿苷（brdU）可干擾優(yōu)勢分裂，故常規(guī)使用BrdU抑制成纖維細胞的生長。

7.48h換液后可得心肌細胞。

人 PBMC 細胞制備

1. 取一15 ml 離心管，加入 2 ml 已用抗凝劑處理過的人血液樣品，再加入等體積的 PBS進行稀釋（終體積 4 ml）。

注：若為經過處理的濃縮血液樣品，請按照新的稀釋倍數合理稀釋。為了保證分離細胞的活力和效率，請使用新鮮血液，血液樣品請于 18-20℃保存。

2. 上下顛倒或用槍混勻樣品，備用。

3. 上下翻轉確保 Ficoll-Paque PLUS (GE)分離液徹底混勻，去掉聚丙烯瓶蓋，使用注射器針頭插入瓶塞吸取 3 ml 分離液。

注：分離之前請將 Ficoll-Paque PLUS 分離液溫預至 18-20℃。

4. 取一新的無菌 15 ml 離心管，加入 3 ml 步驟 3 中取出的分離液。

5. 小心加入稀釋好的 4 ml 血液樣品，不要打破 Ficoll-Paque PLUS 液面。

注：可將離心管傾斜至與水平臺面呈 30°， 緩慢沿管壁加入血液樣品。

6. 將離心管小心豎直放入離心機內，于 18-20℃， 400g 離心 30-40 min。

注：特別注意將離心機的降速加速度調到 0。

7. 小心取出離心管。此時液體分為 3 層：中層為分離液層， 最下層為紅細胞，最上層為血漿。位于中層靠近血漿層的白膜層即為單個核細胞層，小心吸走血漿層，不要打動白膜層。

注：可吸出最上層的血漿層保存以備后續(xù)使用。

8. 用無菌移液槍將白膜層吸到一新的離心管中。

9. 用三倍體積（約 6 ml） 的無菌 PBS 重懸步驟 8 中的 PBMC，重懸時用槍輕柔吹散，于18-20℃， 400g 離心 10-15 min， 重復一次，最后用培養(yǎng)基重懸備用，多余的 PBMC 可以凍存繼續(xù)使用。

特注：在較高的離心速度下（400-500g）可以提高 PBMC 的得率，同時需注意在較低的離心速度下（60-100g）可以分離掉不需要的血小板。另外，如上操作和比例適用于更大體積的分離。