小鼠抗新冠病毒N蛋白IgG亞型抗體ELISA檢測(cè)試劑盒

【間接法酶聯(lián)免疫法定量】

產(chǎn)品貨號(hào)：EKnCov-NAb-02

（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說明書）

聲明：尊敬的客戶，感謝您選用本公司的產(chǎn)品。本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!本試劑盒不含任何具有生物危害成分，但是試劑盒使用涉及的檢測(cè)樣本請(qǐng)?jiān)诰哂邢鄳?yīng)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，由此可能造成的所有生物安全危害由使用者自行負(fù)責(zé)。

本產(chǎn)品適用于體外定量檢測(cè)小鼠血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中鼠源抗新冠病毒S蛋白IgG抗體。使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書并檢查試劑組分！如有疑問，請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系我們。

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試劑盒組成：

組分名稱

規(guī)格

保存條件

數(shù)量

ELISA酶標(biāo)板(包被N蛋白抗原)

96T

-20℃

1

標(biāo)準(zhǔn)品(小鼠抗N蛋白

IgG抗體)干粉

干粉

-20℃

2

濃縮HRP羊抗小鼠IgG（100×）

120ul

-20℃

1

通用稀釋液

30ml

4℃

1

濃縮洗滌液（25×）

30ml

4℃

1

TMB底物液

12ml

4℃

1

反應(yīng)終止液

12ml

4℃

1

酶標(biāo)板覆膜

5

產(chǎn)品說明書

1

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特別說明：

1.打開包裝后請(qǐng)及時(shí)檢查所有物品是否齊全完整。

2.一周內(nèi)使用可存于4℃，需長(zhǎng)時(shí)間保存或多次使用請(qǐng)按保存條件存放。

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檢測(cè)原理:本試劑盒采用經(jīng)活性驗(yàn)證的新冠病毒N蛋白抗原作為包被物，檢測(cè)時(shí)待檢血清或標(biāo)準(zhǔn)品（抗新冠病毒N蛋白IgG型抗體）與包被物結(jié)合，游離成分被洗去，加入HRP羊抗小鼠IgG，最后加入單組份TMB底物液。 如果待檢樣品中含有針對(duì)新冠N蛋白的IgG亞型抗體，TMB底物液在HRP催化下顯色，加入終止液終止顯色后，在酶標(biāo)儀OD450/OD630讀取吸光值，吸光值大小與待檢測(cè)IgG濃度呈正相關(guān)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度/吸光值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計(jì)算出待檢樣品中抗新冠病毒N蛋白IgG型抗體含量。

樣品收集:?

1.血清：全血樣品于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。

2.血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)。避免使用溶血，高血脂樣品。

3.組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。

4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測(cè)。

5.其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)。

6.樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

7.樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測(cè))，或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融。

8.如果您的樣品中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù)）。

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試驗(yàn)所需自備物品:

1.酶標(biāo)儀(450nm波長(zhǎng)濾光片)

2.高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

4.吸水紙

?檢測(cè)前準(zhǔn)備工作:

1.請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2.洗滌液配制：將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫）。當(dāng)日使用 。

3.標(biāo)準(zhǔn)品配制:?向干粉標(biāo)準(zhǔn)品中加入500uL ddH2O,此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為2000pg/mL。然后根據(jù)需要用通用稀釋液?進(jìn)行1：2倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋）, 建議配制成以下濃度：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/mL，通用稀釋液直接作為空白孔0pg/mL。

4.?HRP羊抗小鼠IgG工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計(jì)），用通用稀釋液稀釋實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制100-200μL。

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洗滌方法: ???????????????

1.自動(dòng)洗板機(jī)：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。

2.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干。

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操作步驟:

實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μL，標(biāo)準(zhǔn)品孔別加依次梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，待測(cè)樣品孔加待測(cè)樣品 100μL，給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育 60分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL /每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。 立即每孔加入配好的HRP羊抗小鼠IgG工作液100μL（在使用前15 分鐘內(nèi)配制），注意不要有氣泡，加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育 60分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新配制的二抗。

4.?棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL /每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。每孔加TMB底物溶液100μL，酶標(biāo)板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右（根據(jù)實(shí)際顯色情況酌情縮短或延長(zhǎng)，但不可超過 30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，即可終止）。

5.每孔加終止液 100μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。?

6.立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD值）。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測(cè)程序。

7.實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結(jié)束。

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注意事項(xiàng)：

1.保存：試劑盒中各試劑請(qǐng)按說明書提示合理存放。在儲(chǔ)存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。

2.酶標(biāo)板：剛開啟的酶標(biāo)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。暫時(shí)不用的板條應(yīng)拆卸后放入備用鋁箔袋，按推薦溫度存放！

3.加樣：加樣或加試劑時(shí)，第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔的加樣時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。每次的加樣時(shí)間最好控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔。

4.溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)必須給酶標(biāo)板覆膜；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)；嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

5.洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。

6.顯色時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很明顯，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免顏色過深影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。

7.底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

8.混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用最低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。

9.安全：試驗(yàn)中請(qǐng)穿著實(shí)驗(yàn)服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測(cè)血液或者其他體液樣品時(shí)，請(qǐng)按國(guó)家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條例執(zhí)行。

10.不同批號(hào)的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外）

11.試驗(yàn)中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴(yán)禁混用，否則將影響試驗(yàn)結(jié)果！

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結(jié)果判斷:

1.以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如有設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。亦可以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

3.若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

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靈敏度、檢測(cè)范圍、特異性和重復(fù)性:

●靈敏度：最小可測(cè)15.6pg/mL。

●檢測(cè)范圍：31.25-2000pg/mL。 ?

● 特異性：與其它蛋白無交叉反應(yīng)。

● 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%。

典型數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

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試劑盒說明：

本試劑盒使用具有抗原活性新冠病毒S蛋白抗原作為包被物，小鼠抗新冠病毒N蛋白

IgG亞型抗體，試劑盒檢測(cè)靈敏度高于膠體金，可能出現(xiàn)以下問題：

1.??檢測(cè)過程中可能出現(xiàn)檢測(cè)值過高超過試劑盒檢測(cè)范圍，此時(shí)應(yīng)該進(jìn)一步稀釋樣本重新實(shí)驗(yàn)；

2.??本試劑盒屬于定量試劑盒，沒有定義陰性和陽性閾值，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)根據(jù)陰性血清數(shù)值做出合理判斷，如果待檢血清中非相關(guān)IgG含量過高，由于洗滌不徹底仍可能在陰性血清中測(cè)出較高值。

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*本試劑僅供實(shí)驗(yàn)室研究使用