寫(xiě)在前面

????????今天推薦的是由吉林大學(xué)第一醫(yī)院在2021年6月10日發(fā)表于Journal of Virology（2020IF：5.103，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Wenyan Zhang教授，研究表明去泛素化酶USP21通過(guò)下調(diào)Tat表達(dá)抑制HIV-1復(fù)制。

研究背景

????????泛素化在人類(lèi)免疫缺陷病毒1(HIV-1)感染中起重要作用。HIV蛋白如Vif和Vpx分別通過(guò)蛋白酶體途徑介導(dǎo)宿主蛋白APOBEC3和SAMHD1的降解。然而，去泛素化酶是否在HIV-1感染中起重要作用尚不清楚。

摘要部分

????????在這里，作者證明去泛素化酶USP21通過(guò)間接下調(diào)HIV-1轉(zhuǎn)錄激活因子(Tat)的表達(dá)有效抑制HIV-1的產(chǎn)生，這對(duì)于HIV-1中的轉(zhuǎn)錄延伸至關(guān)重要。USP21通過(guò)其去泛素化酶活性去泛素化Tat。進(jìn)一步研究表明，USP21通過(guò)增加細(xì)胞周期蛋白T1啟動(dòng)子中組蛋白K9的甲基化來(lái)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白T1 mRNA水平，細(xì)胞周期蛋白T1是與Tat和反式激活反應(yīng)元件(TAR)相互作用的正轉(zhuǎn)錄延伸因子b(P-TEFb)的亞基，并且是轉(zhuǎn)錄刺激和Tat穩(wěn)定性所需。此外，USP21對(duì)其他HIV-1輔助蛋白的功能沒(méi)有影響，包括Vif、Vpr、Vpx和Vpu，表明USP21對(duì)Tat具有特異性。這些發(fā)現(xiàn)提高了我們對(duì)USP21介導(dǎo)的HIV-1產(chǎn)生功能抑制的理解。

研究?jī)?nèi)容

1.USP21有效抑制HIV-1的產(chǎn)生? ? ? ?

????????由于UPS在HIV-1感染中的重要作用，作者篩選了一些DUB USP對(duì)HIV-1復(fù)制的影響。為了確定USP是否抑制HIV-1復(fù)制，作者檢查了一系列USP的抗HIV-1能力。作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)TZM-bl細(xì)胞用作感染指示細(xì)胞時(shí)，在USP21存在下感染性HIV-1的產(chǎn)生大大降低，而USP10、USP13、USP20等適度影響HIV-1產(chǎn)量。其他USP成員沒(méi)有顯示效果。USP和Gagp55的水平通過(guò)免疫印跡(IB)分析確定。USP21也明顯降低細(xì)胞內(nèi)Gagp55的表達(dá)。

????????隨著USP21劑量的增加，細(xì)胞裂解液和病毒上清液中Gagp55和CAp24的表達(dá)，以及感染性HIV-1產(chǎn)量，以劑量依賴(lài)性方式下降，進(jìn)一步證實(shí)USP21抑制HIV-1的產(chǎn)生。相比之下，與陰性對(duì)照shRNANC相比，HEK293T細(xì)胞中 sh-USP21的穩(wěn)定敲低導(dǎo)致細(xì)胞裂解物中Gagp55和病毒上清液中CAp24的水平增加。USP21 shRNA細(xì)胞上清液中感染性HIV-1的產(chǎn)生增加了大約2倍。為了進(jìn)一步確定目標(biāo)T細(xì)胞中感染性HIV-1的產(chǎn)生是否隨時(shí)間受到USP21的影響，作者使用靶向USP21和shRNA NC的shRNA構(gòu)建了穩(wěn)定的USP21敲低Jurkat細(xì)胞。與第2天Jurkat細(xì)胞中的shRNA NC相比，敲除USP21誘導(dǎo)感染性HIV-1的產(chǎn)量增加了大約1.5倍，并且這種感染性HIV-1的產(chǎn)量一直保持到第6天。通過(guò)IB分析證實(shí)了Jurkat細(xì)胞中的USP21敲低。

研究結(jié)論：USP21以劑量依賴(lài)性方式有效抑制HIV-1的產(chǎn)生。

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2.USP21對(duì)HIV輔助蛋白（Vif、Vpx、Vpr和Vpu）的功能沒(méi)有影響

????????USP21是一種去泛素化酶，可從靶蛋白中去除多聚泛素化。HIV輔助蛋白Vif、Vpx和Vpr募集宿主E3泛素連接酶復(fù)合物以誘導(dǎo)宿主限制因子A3G、SAMHD1和HLTF的多泛素化，而Vpu參與BST-2降解通過(guò)蛋白酶體或溶酶體途徑。因此，作者試圖確定USP21是否會(huì)導(dǎo)致泛素化A3G、SAMHD1、HLTF或BST-2的去泛素化，以保護(hù)宿主因子免于降解并導(dǎo)致HIV抑制。作者首先檢查了USP21的過(guò)表達(dá)或敲低是否會(huì)影響Vif對(duì)A3G的降解。數(shù)據(jù)顯示USP21對(duì)Vif介導(dǎo)的A3G降解沒(méi)有影響。作者還觀(guān)察到，增加USP21的量對(duì)Vpx介導(dǎo)的SAMHD1、Vpr介導(dǎo)的HLTF或Vpu介導(dǎo)的BST-2降解沒(méi)有影響，表明USP21對(duì)HIV-1的抑制與HIV-1輔助蛋白的功能不相干。為了檢查USP21介導(dǎo)的HIV-1生成減少是否與蛋白酶體或溶酶體降解途徑相關(guān)，將HIV-1野生型(WT)、USP21或?qū)φ蛰d體VR1012共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。細(xì)胞中加入不同的抑制劑，包括蛋白酶體抑制劑MG132、NEDD8激活酶(NAE)抑制劑MLN4924和自噬溶酶體抑制劑氯化銨。這些抑制劑沒(méi)有恢復(fù)USP21對(duì)HIV-1產(chǎn)生的抑制作用。

研究結(jié)論：USP21介導(dǎo)的HIV-1感染性調(diào)節(jié)不是由于從宿主因子A3G、SAMHD1、HLTF和BST-2中去除了多聚泛素化并促進(jìn)了它們的表達(dá)。不僅如此，USP21介導(dǎo)的HIV-1感染性與蛋白酶體和溶酶體途徑也沒(méi)有關(guān)系。

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3.USP21通過(guò)減少Tat表達(dá)來(lái)特異性抑制Tat介導(dǎo)的HIV-1 LTR反式激活

????????HIV-1 LTR驅(qū)動(dòng)HIV-1轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄起始和延伸。Tat與所有病毒轉(zhuǎn)錄本第59末端的TAR元件相互作用并刺激轉(zhuǎn)錄延伸。為了檢查在有無(wú)Tat的情況下USP21對(duì)HIV-1 LTR反式激活的影響，作者使用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)HIV-1 LTR和CMV啟動(dòng)子活性。在沒(méi)有Tat的情況下，USP21對(duì)HIV-1 LTR活性有輕微的抑制作用。在Tat存在下，HIV-1 LTR反式激活被顯著激活，而USP21以劑量依賴(lài)性方式顯著抑制Tat驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性。有趣的是，作者觀(guān)察到USP21也降低了Tat的表達(dá)，這表明USP21介導(dǎo)的HIV-1 LTR反式激活抑制是由于Tat表達(dá)降低所致。在HEK293T細(xì)胞中敲除USP21增加了Tat表達(dá)和Tat介導(dǎo)的HIV-1 LTR激活。為了檢查USP21對(duì)啟動(dòng)子可能的非特異性影響，作者將的USP21與pCMV-luci或pCMV-GFP共表達(dá)。結(jié)果顯示USP21增加了CMV驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性以及綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)，表明USP21降低的Tat表達(dá)是特異性的。

研究結(jié)論：USP21抑制Tat介導(dǎo)的HIV-1 LTR反式激活，但不抑制CMV啟動(dòng)子。

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4.USP21通過(guò)去泛素化Tat來(lái)下調(diào)Tat表達(dá)

????????作者接下來(lái)試圖通過(guò)分析USP21在穩(wěn)定表達(dá)Tat的細(xì)胞系中的作用來(lái)確定USP21是否影響Tat的mRNA水平。在穩(wěn)定表達(dá)Tat的HEK293T細(xì)胞中，USP21降低了Tat的蛋白質(zhì)水平但未顯示mRNA水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)降低，表明USP21引起的Tat下調(diào)發(fā)生在蛋白質(zhì)水平。據(jù)報(bào)道，Tat泛素化對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性至關(guān)重要，因此，作者接下來(lái)探究了去泛素化對(duì)Tat穩(wěn)定性的影響。作為DUB，作者觀(guān)察到USP21明顯降低了K48-linked和K63-linked泛素化的程度，這對(duì)Tat轉(zhuǎn)錄活性很重要，表明USP21誘導(dǎo)的Tat去泛素化導(dǎo)致Tat不穩(wěn)定并抑制Tat驅(qū)動(dòng)的LTR活動(dòng)。作者接下來(lái)使用顯性失活泛素突變體(Ub-KO-Flag)，以檢測(cè)其對(duì)Tat穩(wěn)定性的影響。結(jié)果顯示Ub-KO明顯降低了Tat表達(dá)，而USP21顯示出比Ub-KO更強(qiáng)的降低Tat表達(dá)的能力。為了確認(rèn)USP21的泛素化酶活性是Tat去泛素化所必需的，作者檢測(cè)了去泛素化酶缺陷型突變體(C221A)的影響。正如預(yù)期的那樣，C221A突變體失去了去泛素化K48連接和K63連接的Tat泛素化的能力。這些數(shù)據(jù)支持Tat泛素化對(duì)其穩(wěn)定性很重要的觀(guān)點(diǎn)。

研究結(jié)論：USP21對(duì)HIV-1的抑制與其去泛素化酶活性密切相關(guān)。

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5.USP21介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白T1表達(dá)下調(diào)也有助于降低Tat表達(dá)

????????由于USP21對(duì)Tat下調(diào)的影響比UB-KO更強(qiáng)，作者推測(cè)USP21除了對(duì)Tat泛素化的影響外，還有誘導(dǎo)Tat不穩(wěn)定性的目標(biāo)或機(jī)制。Tat與由CycT1和CDK9組成的正轉(zhuǎn)錄延伸因子b(P-TEFb)復(fù)合物特異性相互作用，刺激HIV-1轉(zhuǎn)錄延伸。先前研究表明CycT1穩(wěn)定HIV-1Tat表達(dá)，作者還探究了USP21對(duì)P-TEFb表達(dá)以及Tat-P-TEFb相互作用的影響。據(jù)報(bào)道，在使用抗Myc珠的免疫沉淀(IP)測(cè)定中，CycT1與Tat特異性相互作用，并增加了Tat表達(dá)。有趣的是，作者觀(guān)察到USP21還以劑量依賴(lài)性方式降低CycT1表達(dá)，但在CycT1和CDK9異位表達(dá)時(shí)增加了CDK9的蛋白質(zhì)水平。因此，USP21沉默增加了內(nèi)源性CycT1的蛋白質(zhì)和mRNA水平，但略微降低了內(nèi)源性CDK9的蛋白質(zhì)水平，并且對(duì)內(nèi)源性CDK9的mRNA水平?jīng)]有影響。此外，即使在USP21存在的情況下，增加CycT1的量也能恢復(fù)Tat的表達(dá)并促進(jìn)LTR驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性。因此，USP21敲低增強(qiáng)了Tat介導(dǎo)的LTR激活，而CycT1敲低減弱了Tat介導(dǎo)的LTR激活，而當(dāng)CycT1被敲低后，由USP21敲低誘導(dǎo)的Tat介導(dǎo)的LTR激活就消失了。

?研究結(jié)論：USP21通過(guò)降低細(xì)胞周期蛋白T1(ycT1)mRNA水平來(lái)抑制Tat表達(dá)。

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6.USP21的去泛素化酶活性是HIV-1抑制和Tat下調(diào)所必需的

????????為了探究USP21介導(dǎo)的HIV感染抑制是否與其去泛素化酶活性相關(guān)，將HIV-1NL4-3感染性克隆與USP21 WT或去泛素化酶缺陷型突變體(C221A)共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。USP21 WT的過(guò)表達(dá)顯著降低了上清液中細(xì)胞內(nèi)HIV-1 Gagp55和CAp24的表達(dá)以及HIV-1的產(chǎn)生，而USP21 C221A突變體導(dǎo)致HIV-1病毒蛋白的表達(dá)和HIV-1產(chǎn)量減少50%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證USP21的去泛素化酶活性是否參與HIV-1抑制，作者比較了USP21 WT和C221A突變體對(duì)Tat表達(dá)和HIV-1 LTR反式激活的影響。與USP21 WT相比，USP21 C221A突變體在Tat下調(diào)和抑制LTR活性方面也存在缺陷。與空載體相比，USP21 WT及其突變體都沒(méi)有任何顯著的細(xì)胞毒性，表明USP21的功能不是由于其細(xì)胞毒性。作者接下來(lái)檢查了USP21 C221A突變體是否影響CycT1表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，作者發(fā)現(xiàn)USP21 C221A突變體也缺乏降低CycT1表達(dá)的能力。共定位分析表明，USP21 WT分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，并與主要存在于細(xì)胞核中的CycT1共定位，而USP21 C221A突變體主要位于細(xì)胞質(zhì)中；因此，它不能與CycT1共定位，導(dǎo)致其有缺陷的CycT1下調(diào)。

?研究結(jié)論：USP21通過(guò)去泛素化Tat和下調(diào)Tat穩(wěn)定性所必需的CycT1表達(dá)來(lái)影響Tat表達(dá)。

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7.USP21通過(guò)表觀(guān)遺傳修飾CycT1啟動(dòng)子來(lái)降低CycT1的表達(dá)

????????為了探索USP21如何降低CycT1表達(dá)，作者首先檢查了UPS是否參與USP21對(duì)CycT1的下調(diào)。作者發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑MG132、NEDD8激活酶(NAE)抑制劑MLN4924和自噬溶酶體抑制劑NH4Cl對(duì)USP21介導(dǎo)的CycT1下調(diào)沒(méi)有影響，表明USP21對(duì)CycT1的下調(diào)不涉及泛素化機(jī)制。作者接下來(lái)通過(guò)構(gòu)建CycT1-Luc表達(dá)載體研究了USP21對(duì)CycT1啟動(dòng)子的影響。結(jié)果顯示USP21影響CycT1啟動(dòng)子的活性。基于Genome Browser分析，作者發(fā)現(xiàn)CycT1啟動(dòng)子具有表觀(guān)遺傳修飾，包括組蛋白3K4和K9甲基化和組蛋白3K27乙?；?。ChIP測(cè)定顯示USP21表達(dá)明顯增加H3K9甲基化，但對(duì)H3K4甲基化或H3K27乙?；瘺](méi)有影響，導(dǎo)致CycT1表達(dá)降低。此外，作者發(fā)現(xiàn)USP21不影響3-磷酸甘油醛脫氫酶和CDK9啟動(dòng)子上的H3K9甲基化標(biāo)記，表明對(duì)CycT1啟動(dòng)子的影響是特異性的。

研究結(jié)論：USP21是HIV-1產(chǎn)生的新型調(diào)節(jié)劑，并且該調(diào)節(jié)與USP21去泛素化酶活性有關(guān)。

結(jié)論與討論

????????在這項(xiàng)研究中，作者篩選了一些USP家族成員對(duì)HIV-1感染的影響，發(fā)現(xiàn)USP21通過(guò)下調(diào)Tat表達(dá)有效抑制HIV-1的產(chǎn)生。USP21的去泛素化酶活性對(duì)于Tat下調(diào)至關(guān)重要;然而，除了去泛素化Tat泛素化外, USP21還通過(guò)表觀(guān)遺傳修飾降低CycT1 mRNA水平，這是Tat穩(wěn)定所必需的。因此, 作者表明USP21是HIV-1 Tat的新型選擇性調(diào)節(jié)劑。作者的發(fā)現(xiàn)為HIV-1藥物的開(kāi)發(fā)和治療提供了一個(gè)重要的靶標(biāo)。

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原文鏈接：https://doi.org/10.1128/jvi.00460-21