在中國，原發(fā)性肝癌發(fā)病率居第4位、死亡率高居第2位。肝癌的主要組織學(xué)類型是肝細(xì)胞癌（HCC），占原發(fā)性肝癌的75-85%，治療肝癌的臨床一線藥物索拉非尼等，雖可一定程度提高晚期HCC患者的生存率，然而缺乏靈敏的診斷標(biāo)記物和肝癌耐藥是臨床診療中亟待解決的問題。近幾年，雖然環(huán)狀RNA（circRNA）被大量發(fā)現(xiàn)，但僅有極小部分circRNA具有癌癥診斷標(biāo)志物及治療靶點的潛力。

circRNA是高穩(wěn)定性的一類非編碼RNA，在多種疾病尤其是癌癥的進展中發(fā)揮著重要作用。然而，其在HCC發(fā)生和轉(zhuǎn)移及耐藥中的潛在機制仍不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)源自ZKSCAN基因的circZKSCAN1在HCC病人組織中表達顯著降低。circZKSCAN可能是HCC發(fā)生發(fā)展過程的關(guān)鍵因子，可能作為HCC診斷和治療的新生物標(biāo)志物或靶點。探究其在HCC中的機制能為HCC患者的診治提供新思路。

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院李向東教授課題組在Molecular Cancer（IF=41.444）發(fā)表了題為“A novel polypeptide encoded by the circular RNA ZKSCAN1 suppresses HCC via degradation of mTOR”的文章。在此文中，通過分析HCC的circRNA測序數(shù)據(jù)庫，選擇了circZKSCAN1進行了深入研究。通過質(zhì)譜、多糖體分級分析、雙熒光素酶報告等實驗表明，circZKSCAN1編碼一個新多肽-circZKSaa。通過免疫沉淀、質(zhì)譜和免疫熒光染色等分析驗證了多肽circZKSaa和mTOR間的關(guān)系。最終表明，新的circZKSCAN1編碼肽在PI3K/AKT /mTOR通路上起抑制腫瘤的作用，并通過介導(dǎo)mTOR的泛素化使HCC細(xì)胞對肝癌一線藥物索拉非尼敏感；該circZKSaa具有作為HCC治療靶點和臨床生物標(biāo)志物的潛力。

絕大多數(shù)的研究報道，circRNAs作為“miRNA海綿”行使其功能。有趣的是，該研究證明circZKSCAN1無miRNA海綿功能，而是翻譯為新肽（circZKSaa），該多肽可增加HCC細(xì)胞對肝癌一線藥物索拉非尼的敏感性。circZKSaa通過與FBXW7互作促進mTOR泛素化，最終抑制HCC細(xì)胞增殖。

1 circZKSCAN1在HCC組織中下調(diào)，對索拉非尼治療敏感

為確定HCC差異表達的circRNA，研究者分析了HCC的circRNA譜數(shù)據(jù)，獲得5種差異表達circRNA。使用30對臨床組織（HCC vs.正常）及HCC細(xì)胞系（SNU-387、Hep3B、Huh-7、HCC-LM3和SNU-398 vs.正常THL-2）檢測了這5種circRNA的表達?；贕EO數(shù)據(jù)庫中索拉非尼耐藥性HCC患者的數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析，最終確定了circZKSCAN1。研究提示了circZKSCAN1在HCC進展和治療中起重要作用。

2? circZKSCAN1編碼一個206 氨基酸（aa）的多肽

作者通過RIP實驗觀察到在AGO2沉淀中circZKSCAN1無富集，推測circZKSCAN1在HCC中無“miRNA海綿”的作用。通過克隆了串聯(lián)的Renilla Luciferase Luciferasse（Rluc–Luc）間的兩個IRSE位點（IRSE-1和IRSE-2），測量了Luc相對于RLuc的熒光素酶活性。結(jié)果表明IRSE-1和IRSE-2都可誘導(dǎo)核糖體進入，提示了circZKSCAN1 具有翻譯潛能。進一步發(fā)現(xiàn)circZKSCAN1幾乎在HCC-LM3多聚核糖體的所有部分中都存在。通過過表達circZKSCAN1和多肽-circZKSaa，過表達circZKSCAN1 mut（突變體）實驗及檢測了circZKSaa在正常肝臟和HCC中的表達，研究發(fā)現(xiàn)circZKSCAN1在HCC細(xì)胞中編碼一個206aa的新多肽。

3? circZKSaa對HCC有臨床診斷價值

通過對比來自12對組織（HCC腫瘤vs.配對的正常組織）中circZKSaa的表達，發(fā)現(xiàn)circZKSaa在腫瘤中顯著降低。對29 對HCC患者組織的circZKSaa受試者工作曲線（ROC）分析表明，ROC線下面積（AUC）顯示其診斷特異性為100%。研究發(fā)現(xiàn)circZKSaa在circZSKaa轉(zhuǎn)染的HCC-LM3和293 T細(xì)胞的上清液中分泌；且circZKSCAN1在HCC患者血清中低表達，表明了circZKSCAN1和/或多肽circZKSaa作為HCC患者的生物標(biāo)志物的潛能。進一步結(jié)果表明，索拉非尼處理48小時后，circZKSaa的表達以劑量和時間依賴的方式增加， circZKSaa肽可增強索拉非尼在HCC細(xì)胞中的抗腫瘤作用。

4? circZKSCaa抑制HCC細(xì)胞系的生長

研究者構(gòu)建了一系列穩(wěn)定的細(xì)胞系，如線性circZKSaa過表達細(xì)胞、circ-ZKSCAN1過表達細(xì)胞，突變circZKSaa起始密碼子細(xì)胞（circZKSCAN1 mut）、下調(diào)細(xì)胞（sh-circZKSCAN1），以及各自的對照細(xì)胞（sh scramble和Vector）。通過RT-PCR和Western Blot實驗證明了circZKSaa可抑制細(xì)胞周期。

5? circZKSaa促進腫瘤細(xì)胞凋亡

為了進一步探討circZKSaa在體內(nèi)的作用，將穩(wěn)定過表達的circZKSaa和circZKSCAN1 mut HCC細(xì)胞系皮下注射到裸鼠中。觀察到，circZKSaa過表達組中的腫瘤體積較小，而circZKSCAN1 mut中腫瘤與對照組相同；circZKSaa敲除組的腫瘤更大。動物研究表明，circZKSaa抑制HCC細(xì)胞的增殖并促進細(xì)胞凋亡，表明circRNA編碼肽-circZKSCaa具有HCC治療靶點的潛能。

6? circZKSaa通過抑制mTOR磷酸化防止AKT激活

研究者檢查了HCC腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵參數(shù)，如磷酸-ERK1/2（Thr202/Tyr204）、β-catenin和p-AKT-ser473。發(fā)現(xiàn)p-AKT-ser473顯著下調(diào)，而p-AKT-thr308無明顯變化。檢查了mTOR或PDK1與circZKSaa互作的潛力。結(jié)果顯示，在mTOR抗體介導(dǎo)的沉淀中可檢測到circZKSaa,且circZKSaa與mTOR共定位。進一步發(fā)現(xiàn)circZKSaa過表達使S6K1和MDM2的磷酸化失活，證實了circZKSaa分別抑制AKT和mTOR的下游途徑抑制HCC腫瘤。

7? circZKSCaa通過與FBXW7相互作用降解mTOR

通過抑制HCC細(xì)胞中新的蛋白質(zhì)合成和蛋白酶體抑制實驗、 Co-IP測定等一系列實驗，研究表明circZKSaa和FBXW7可以相作。免疫熒光染色顯示，circZKSaa與FBXW7在HCC細(xì)胞中共定位。結(jié)果表明，circZKSaa可能通過FBXW7蛋白影響mTOR蛋白的泛素化水平。通過一系列實驗表明，當(dāng)circZKSaa在細(xì)胞中過表達時，F(xiàn)BXW7與mTOR的結(jié)合增加。免疫沉淀和免疫熒光實驗表明，circZKSaa可通過Fbw7介導(dǎo)與mTOR的631和635區(qū)域與相互作用。

小結(jié)

研究表明，circZKSCAN1編碼一種新的多肽-circZKSaa，該多肽通過與FBXW7結(jié)合，介導(dǎo)mTOR的泛素化降解，進而抑制HCC細(xì)胞的增殖；此外該多肽還增加了HCC細(xì)胞對一線藥物索拉非尼的敏感性。因此，circZKSaa是一種潛在的臨床生物標(biāo)志物和HCC的治療靶點。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1186/s12943-023-01719-9

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