6月22日，國際學術期刊Developmental Cell在線發(fā)表了國科大杭州高等研究院生命與健康學院/中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心周斌研究組合作研究成果“Intercellular Genetic Tracing of Cardiac Endothelium in the Developing Heart”。該研究結合合成生物學與體內(nèi)遺傳學技術，創(chuàng)建了研究心臟發(fā)育的鄰近細胞譜系示蹤新工具。利用該技術，研究人員重新闡明心臟早期發(fā)育過程中心內(nèi)膜及冠狀動脈發(fā)育譜系建立，并發(fā)現(xiàn)心臟內(nèi)皮細胞在正常發(fā)育過程中并不具有造血功能，而是形成冠狀血管內(nèi)皮細胞。該工作為人們更清楚地了解心臟早期發(fā)育、心臟免疫細胞起源及臨床心臟損傷修復提供研究基礎，也為體內(nèi)鄰近細胞研究提供重要技術指導。南模生物為該研究構建了WT1-mGFP和Nfatc1-aGFP-N-tTA基因修飾小鼠。

細胞與細胞通訊能夠進行信號傳遞、功能調(diào)節(jié)等，是多細胞生物中基本的細胞行為。構建鄰近細胞遺傳譜系示蹤新技術，闡明細胞與細胞之間的相互作用及鄰近細胞譜系對解析生命活動及細胞機理具有重要意義。Notch信號通路屬于經(jīng)典的細胞之間交流通路，其主要依賴于鄰近細胞之間的Notch配體與Notch受體結合，引起受體胞內(nèi)段被γ-secretase切割，然后胞內(nèi)段入核調(diào)控下游基因的表達?；贜otch通路工作原理，有研究構建了人工合成的Notch信號通路，稱為Synthetic Notch(synNotch)。通過在體外細胞水平表達人工合成的Notch配體與Notch受體，當配體與受體結合，就會誘導下游人工原件的激活，從而實現(xiàn)了細胞與細胞的鄰近標記。近期，周斌研究組進一步地利用synNotch首次在哺乳動物體內(nèi)創(chuàng)建了鄰近細胞遺傳示蹤技術(gTCCC技術)。此技術原理為，將Notch配體的胞外段替換為mGFP，而將Notch受體的胞外段替換為αGFP，Notch受體的胞內(nèi)段替換為tTA，Notch受體的跨膜域保持不變，再結合tetO-on與Cre-loxP系統(tǒng)，當受體細胞與配體細胞接觸時，就可以實現(xiàn)對受體細胞進行遺傳標記。利用基于synNoth的細胞鄰近標記技術，周斌研究組揭示了胚胎早期心臟內(nèi)皮向肝臟的遷移，以及在腫瘤生長過程中腫瘤血管內(nèi)皮細胞遷移到腫瘤外包膜的現(xiàn)象，這展現(xiàn)了synNotch在體內(nèi)鄰近細胞研究方向具有重大應用前景。心臟早期內(nèi)皮主要分為兩群，這兩個亞群具有空間分布特點，第一群為最早在胚胎發(fā)育第8.0天(E8.0)左右出現(xiàn)的心管內(nèi)皮細胞，稱為心內(nèi)膜;第二群為E12.5左右出現(xiàn)的心外膜下內(nèi)皮細胞及其譜系。然而受于目前遺傳工具的限制，還無法實現(xiàn)在體內(nèi)對于這兩種內(nèi)皮細胞亞群進行特異性標記示蹤。另一方面，有研究報道工具小鼠Nfatc1-Cre標記的心內(nèi)膜屬于生血內(nèi)皮，在E9.5左右具有短暫造血活性，并且這些心內(nèi)膜來源的血細胞能進入血液循環(huán)，然而Nfatc1并不是心內(nèi)膜特異性分子標記，引起了領域內(nèi)的爭議。這一科學問題的解決需要建立心內(nèi)膜特異性遺傳工具進行細胞命運示蹤。基于以上科學問題，周斌研究組基于synNotch構建了多種鄰近細胞標記技術實現(xiàn)了對心臟內(nèi)皮細胞亞群的譜系示蹤，并進一步探究了心臟發(fā)育期內(nèi)皮細胞的造血活性。

首先研究人員利用已構建的Tnnt2-mGFP工具小鼠使心肌細胞表達synNotch配體，又構建了Nfatc1+細胞特異性表達synNotch受體的工具小鼠Nfatc1-αGFP-N-tTA(Nfatc1-antiGFP nanobody-Notch transmembrane domain-tTA)。研究發(fā)現(xiàn)在Nfatc1-αGFP-N-tTA中，Nfatc1除了在心內(nèi)膜細胞表達，還表達在兩種已知的卵黃囊(YS)和主動脈-性腺-中腎區(qū)(AGM)生血內(nèi)皮細胞中，說明Nfatc1并不是心內(nèi)膜特異性分子標記。然而在Tnnt2-mGFP;Nfatc1-αGFP-N-tTA;tetO-Cre;R26-tdT (CM-Endo-gTCCC)小鼠中，由于Tnnt2特異性表達在心肌細胞，所以只有與Tnnt2+心肌細胞接觸的Nfatc1+內(nèi)皮細胞才會激活synNotch信號，從而對受體細胞進行遺傳標記。研究人員收取E16.5 CM-Endo-gTCCC胚胎并驗證只有心臟內(nèi)側的Nfatc1+心內(nèi)膜細胞被tdT標記示蹤，免疫熒光染色及流式細胞分析顯示這些被標記的心內(nèi)膜并不會分化為心臟駐留型免疫細胞或外周血細胞，這些心內(nèi)膜細胞主要分化形成冠狀血管內(nèi)皮細胞。

在E12.5左右，靜脈竇來源的內(nèi)皮細胞開始侵入心外膜下作為心臟第二群內(nèi)皮細胞來源，這群內(nèi)皮細胞在侵入心臟時可能會與心外膜發(fā)生相互作用，為了驗證這一點并標記心臟外側來源的內(nèi)皮細胞，研究人員構建了心外膜細胞特異性表達synNotch工具小鼠Wt1-mGFP。然后對Wt1-mGFP;Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-Cre;R26-tdT (Epi-EC-gTCCC)小鼠心臟進行驗證，發(fā)現(xiàn)在心臟發(fā)育中與心外膜接觸過的內(nèi)皮細胞被成功標記為tdT，這些細胞主要分布在心肌層外側的致密層，研究人員也驗證了這群心肌層外側內(nèi)皮細胞也不具備造血活性。為了更全面地驗證心臟內(nèi)皮細胞造血潛能，研究人員構建了Tnnt2-mGFP;Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-Cre;R26-tdT(CM-EC-gTCCC)工具小鼠并實現(xiàn)了對所有心臟內(nèi)皮細胞無差別標記示蹤(包括內(nèi)側和外側內(nèi)皮細胞)，然而依然無法檢測到心臟內(nèi)皮細胞的造血活性。綜上，研究人員利用synNotch構建了新的細胞鄰近標記技術并成功實現(xiàn)了對心臟不同區(qū)域內(nèi)皮細胞的遺傳示蹤，也進一步確認心臟內(nèi)皮細胞在正常發(fā)育過程中不具備造血活性，為更準確地認識心臟早期發(fā)育、細胞起源及臨床心臟損傷修復提供研究基礎，也為心臟鄰近細胞研究提供重要技術支持。

心肌細胞表達synNotch配體，內(nèi)皮細胞表達synNotch受體，當心肌細胞與內(nèi)皮細胞發(fā)生細胞接觸，synNotch配體與受體就會結合并引起胞內(nèi)段tTA入核結合到tetO啟動子，激活Cre的表達并介導Cre-loxP重組，最終將受體細胞(心臟內(nèi)皮細胞)高效、特異性標記為tdT。對tdT+內(nèi)皮細胞進行遺傳譜系示蹤，揭示心臟內(nèi)皮細胞并不具備造血活性，心內(nèi)膜細胞在心臟發(fā)育過程中主要是形成冠狀血管內(nèi)皮細胞。原文鏈接：https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCULATIONAHA.123.062788

本文轉載自中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心官網(wǎng)