中文標題：藻酸鹽寡糖化小鼠的微生物群成功減輕了小腸粘膜炎

研究對象：小鼠

發(fā)表期刊：Microbiome

影響因子：14.650

發(fā)表時間：2020年8月

合作單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院與青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

運用歐易/鹿明生物技術(shù)：LC-MS非靶向代謝組學(xué)（由鹿明生物提供技術(shù)支持）、轉(zhuǎn)錄組、16S微生物多樣性檢測等；

研究背景

腸道粘膜炎癥是用抗癌藥物如白消安（busulfan）、5-氟尿嘧啶或FOLFOX化療的副作用。由于胃腸道（GI）起著至關(guān)重要的作用，如：保護機體免受病原微生物的侵害，營養(yǎng)物質(zhì)的消化/吸收、粘液和激素分泌等。

盡管已經(jīng)提出了許多方法，如應(yīng)用益生元、益生菌、硒、揮發(fā)油等來減少化療引起的腸道粘膜炎，但進展甚微。海藻酸鈉寡糖（AOS）是從海藻酸鈉降解中得到的天然產(chǎn)物，含有聚甘露糖醛酸、聚古羅糖醛酸和雜合褐藻寡糖3種成分，被認為有抗氧化、抗炎癥、抗細胞凋亡及增殖的作用。AOS通過增強細胞連接、恢復(fù)小腸功能以及改善可能有助于基因表達的轉(zhuǎn)錄因子來改善busulfan干擾的腸細胞膜；AOS改善血液代謝，以支持小腸功能的恢復(fù)。隨后還發(fā)現(xiàn)，AOS可能通過增加“有益”腸道微生物和減少“有害”腸道微生物而有益于腸道微生物群。

據(jù)報道，腸道微生物群影響我們健康的許多方面，因為它提供營養(yǎng)和維生素，對抗病原體，維持上皮粘膜的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并支持人體免疫系統(tǒng)。它也被應(yīng)用于許多疾病模型和臨床試驗中，治愈率非常高，副作用很少。FMT（糞便移植）已經(jīng)被證明可以有效地控制腸道微生物群，改善化療引起的粘膜炎。

研究思路

研究結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)AOS減輕了抗癌藥物busulfan誘導(dǎo)的小腸細胞膜的損傷，特別是細胞連接和微絨毛；同時，AOS支持血液代謝來幫助小腸恢復(fù)。這是因為腸道微生物群可以代謝營養(yǎng)物質(zhì)，也可以調(diào)節(jié)腸道代謝物來影響血液代謝組分。

在本研究中，作者探討了busulfan和/或AOS治療后腸道菌群的變化，分為3組：（1）A0（ddH2O）；（2）BA0（busulfan+ddH2O）；（3） BA10（busulfan+AOS）。通過PCoA分析（PCoA；圖1a）可以清楚地區(qū)分三種處理之間細菌組成的差異。在屬水平上，BA10組中的乳酸桿菌的比例顯著增加。LEfSe分析評估了這些處理之間不同菌屬的差異，擬桿菌科在BA10中富集，表明AOS可以增加“有益”腸道微生物群（圖1c，d）。

另一項研究表明，經(jīng)過5周的AOS給藥期后，AOS增加了“有益菌”，如擬桿菌、乳酸桿菌，而減少了“有害菌”如脫硫弧菌科。血液代謝物和腸道菌群之間有很好的相關(guān)性（圖1e），將微生物分為兩大類，代謝物分為三大類。結(jié)果表明AOS治療有利于腸道菌群進而改善小腸功能。

圖1 | AOS給藥后小腸腸道菌群變化及菌群與代謝物的相關(guān)性分析

（a）不同處理條件下腸道菌群的PLS-DA分析；

（b）在門級水平上的菌群豐度差異；

（c和d）LEfSe和LDA分析；

（e）LEfSe和LDA分析；

AOS有益于腸道微生物群進而改善busulfan引起的小腸功能損傷，該研究探討了FMT對小腸功能的有益改善作用。分別從AOS（10 mg/kg或100 mg/kg）或ddH2O處理組中收集腸道微生物群（圖2a）。同時，A10-FMT和A100-FMT通過增加Vil1的蛋白表達水平來恢復(fù)小腸功能（圖2b）。

為探討A10FMT/A100-FMT改善小腸功能的機制，采用RNA-seq分析對小鼠小腸進行基因表達譜分析。與Sa相比，Con-FMT中166個基因下調(diào)表達，308個基因上調(diào)表達；A10-FMT中179個基因下調(diào)表達，540個基因上調(diào)表達；A100-FMT中267個基因下調(diào)表達，572個基因上調(diào)表達（圖2c）。這些差異表達基因的KEGG信號通路分析結(jié)果表明：在這三個比較（Sa vs Con FMT；Sa vs A10-FMT；Sa vs 與A100-FMT）中，最顯著富集的信號通路是NOD-like receptor signaling pathway、antigen processing and presentation、cell adhesion molecules (CAMs)，提示FMT可能有利于小鼠腸道的免疫功能（圖2d-f）。

圖2 | 小腸的轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果

（a）糞便移植的實驗設(shè)計流程圖；

（b）免疫熒光檢測結(jié)果；

（c）不同比較組中的差異表達基因聚類結(jié)果；

（d-f）差異表達基因的pathway富集分析結(jié)果；

此外，多重富集分析（Metascape）結(jié)果表明，常見功能群與細胞防御有關(guān)（圖3a，b），最特異的功能在Sa vs A10-FMT顯著富集，包括能夠幫助小腸功能恢復(fù)的細胞粘附分子、消化和吸收（圖3a）。結(jié)果表明，A10-FMT對小腸功能的改善最為有利，即AOS 10mg/kg是改善小腸的最佳濃度。由于“CAM”在RNA-seq數(shù)據(jù)中富集，因此在小腸樣本中測定了重要的細胞粘附分子的蛋白表達水平。重要細胞連接分子ZO1、Cx37、連環(huán)蛋白、E-cad（E-cadherin）和claudin的蛋白水平在Sa組最低，在Con-FMT中較高，在A10-FMT和A100-FMT中最高（圖3c）。轉(zhuǎn)錄因子SOX4、GATA4和KLF7的蛋白質(zhì)水平在Sa中最低，而在A100-FMT中最高（圖3e）。同時，p-PTEN和Bcl-xl的蛋白水平表明，Sa和Con-FMT的凋亡水平較高，而A10-FMT和A100-FMT的凋亡水平較低（圖3f）。結(jié)果表明：A10-FMT和A100-FMT比Con-FMT更有益于busulfan受損的小腸。

圖3 | 多重富集分析及細胞黏連蛋白表達分析

（a）多重富集分析結(jié)果；

（b）Circos plots展示不同比較組之間的關(guān)聯(lián)；

（c-f）細胞黏連蛋白的免疫熒光及WB結(jié)果；

通過16S rDNA來分析FMT通過腸道菌群改善小腸功能的作用。A10FMT和A100-FMT組的“有益菌”擬桿菌水平較高，而Sa和Con FMT組中“有害菌”厚壁菌的水平升高（圖4b）；“有害菌”Akkermancia只存在于Sa組。此外，A10-FMT和A100-FMT的擬桿菌/厚壁菌比率高于Sa或Con- FMT（圖4c），這表明A10-FMT和A100-FMT對腸道微生物群的益處比Con-FMT更大。LEfSe分析進一步探討四組之間菌群差異（圖4d，e），Leuconostocaceae在A100-FMT中富集，表明A100-FMT增加了有益菌。FMT研究中的A10-FMT/Sa和AOS直接處理研究中的BA10/BA0的比率在“門”水平上顯示出相似的趨勢（圖4f），這表明這兩個研究中的微生物有很好的相關(guān)性。

圖4 | FMT處理后腸道菌群的變化

（a）不同處理組中腸道菌群的PLS-DA分析；

（b）門水平上的菌群豐度差異；

（c） Bacteriodetes to Firmicutes比率在不同比較組中的分布統(tǒng)計；

（d-e）LDA和LEfSe分析；

（f）在門水平上不同菌群的不同組中的比率統(tǒng)計以分析其表達相關(guān)性；

腸道微生物群在營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收中起著至關(guān)重要的作用，從而影響血液代謝，因此利用LC-MS非靶向代謝組學(xué)研究FMT對血液代謝的影響，并分析了血液代謝物與腸道菌群之間的相關(guān)性。Con-FMT、A10-FMT和A100-FMT顯著改變血液代謝物，在Sa vs Con-FMT、Sa vs A10-FMT和Sa vs A100-FMT中，分別有131、132和129種代謝物發(fā)生顯著變化（圖5a-c）。值得注意的是，Sa vs A10-FMT和Sa vs A100-FMT的53個常見代謝物具有相似的趨勢（圖5j），這表明A10-FMT和A100-FMT可能以相同的方式影響血液代謝物。30個代謝物在control vs Sa, Sa vs A10-FMT, and Sa vs A100-FMT共有，其中15個代謝物被busulfan (in control vs. Sa)誘導(dǎo)顯著增加，而A10-FMT和A100-FMT使其顯著減少（Sa vs A10-FMT和Sa vs A100-FMT；圖5k），表明，A10-FMT和A100-FMT對血液代謝組產(chǎn)生了顯著改善。這30種代謝物中大部分是脂類分子，在小腸功能中起著重要作用，這表明A10-FMT/A100-FMT在血液中恢復(fù)了那些被busulfan擾亂的代謝物。

圖5 | FMT處理后血漿代謝物的變化

（a-c）不同處理組中差異代謝物的聚類分析結(jié)果；

（d-f）不同處理組中的OPLS-DA分析；

（g-i）不同處理組中差異代謝物的相關(guān)性分析；

（j-k）不同處理組中共有代謝物的表達聚類分析；

顯著變化代謝物的KEGG代謝通路分析表明：choline metabolism in cancer、glycerophospholipid metabolism、retrograde endocannabinoid signaling、linoleic acid metabolism、glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor biosynthesis這些通路在Sa vs Con-FMT、Sa vs A10-FMT和Sa vs A100-FMT共同富集（圖6a-c）。fat digestion and absorption、cholesterol metabolism、carbohydrate digestion and absorption、vitamin digestion and absorption 在A100-FMT中特異性富集（圖6a-c）。這些途徑反映了A10-FMT和A100-FMT在改善小腸功能方面的優(yōu)勢。用Spearman相關(guān)系數(shù)分析血液代謝物與腸道菌群的相關(guān)性（圖6d），結(jié)果表明：血液代謝物分為兩組（上下）；大部分代謝物在control vs Sa中增加，而A10-FMT和A100-FMT使其減少。菌群也被分成兩大類（左和右），上簇中的代謝物與右簇中的微生物呈正相關(guān)，而下簇中的代謝物與左簇中的微生物正相關(guān)。Lactobacillales與上簇代謝產(chǎn)物呈正相關(guān)，這表明“有益菌”乳酸桿菌有助于血液代謝產(chǎn)物的恢復(fù)。同時，Mycoplasmatales與下簇代謝物呈正相關(guān)，這表明“有害菌”支原體不能協(xié)助血液代謝物的回收。提示A10-FMT和A100-FMT可改善小腸功能和腸道菌群，恢復(fù)血液代謝。

圖6 | FMT處理后血漿代謝物的代謝通路分析及相關(guān)性分析

（a-c）不同處理組中差異代謝物的代謝通路分析；

（d）代謝物與腸道菌群的相關(guān)性分析；

研究結(jié)論

在目前的研究中，AOS-dosed的FMT通過調(diào)控基因表達和提高細胞連接蛋白來明顯改善小腸。AOS-dosed的FMT通過增加“有益菌”Leuconostocaceae和促使血液代謝組學(xué)的恢復(fù)來發(fā)揮其腸道菌群的優(yōu)勢。FMT從一個具有優(yōu)良微生物的供體誘導(dǎo)了小腸功能的恢復(fù)。表明AOS處理的腸道微生物群供體可用于預(yù)防化療藥物或其他因素在受體中引起的小腸粘膜炎。

小鹿推薦

本文通過LC-MS非靶向代謝組、16s微生物多樣性、轉(zhuǎn)錄組等多種檢測手段發(fā)現(xiàn)了海藻酸鈉寡糖（AOS）是從海藻酸鈉降解中得到的天然產(chǎn)物，AOS通過增強細胞連接、恢復(fù)小腸功能以及改善可能有助于基因表達的轉(zhuǎn)錄因子來改善busulfan干擾的腸細胞膜；AOS改善血液代謝，以支持小腸功能的恢復(fù)；AOS可能通過增加“有益”腸道微生物和減少“有害”腸道微生物而有益于腸道微生物群。AOS-dosed的FMT證明可以有效地控制腸道微生物群，改善化療引起的粘膜炎。

文末看點｜lumingbio

歐易/鹿明生物推出的16s+代謝組學(xué)的多層組學(xué)研究思路繼本篇文章前已先后助力了浙江工業(yè)大學(xué)、中國農(nóng)科院、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)等在微生物一區(qū)頂刊Microbiome、醫(yī)學(xué)一區(qū)頂刊GUT發(fā)表文章。

歡迎百度搜索鹿明生物——訪問鹿明生物官網(wǎng)——了解多組學(xué)技術(shù)（LC-MS非靶向代謝組、16s微生物多樣性、轉(zhuǎn)錄組）

猜你還想看

◆項目文章 | 恭喜青島農(nóng)大科學(xué)家多層組學(xué)文章喜登Gut

◆項目文章 | 運用16S+代謝組學(xué)揭示乳果糖緩解鹽敏感型高血壓的作用機制

◆Hepatology | 運用16S+靶向代謝組學(xué)可區(qū)分重度飲酒和酒精性肝炎患者

◆16S+代謝組學(xué)助力發(fā)文醫(yī)學(xué)一區(qū)行業(yè)頂刊《Gastroenterology》

本文系鹿明生物原創(chuàng)