RNase在核酸代謝中發(fā)揮著重要作用，幾乎任何一種原核生物與真核生物細(xì)胞類型中均可找到RNase。眼淚、唾液、粘液和汗液等體液中分泌這些RNase，通過它們來防御微生物的入侵。RNase也存在于皮膚碎屑中，掉落于實驗臺的毛發(fā)上，或粘附于衣物的寵物毛發(fā)內(nèi)。不過，大多數(shù)環(huán)境中RNase的首要來源是微生物——即細(xì)菌和真菌。在操作過程中，必須消除、檢測和抑制RNase。

關(guān)于RNase酶

RNase——特別是RNase A家族的成員——是一些微小緊湊的蛋白，它們含有一些半胱氨酸殘基能夠形成許多分子內(nèi)二硫鍵。因此在恢復(fù)至室溫后，在無變性劑存在的條件下，變性的RNase會重新恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)及部分功能。因此，RNase在反復(fù)凍融，甚至高壓滅菌后仍會保留相當(dāng)?shù)幕钚?。這些酶類穩(wěn)定的天然屬性使它們對眾多的去污染方法具有抵抗性，通常需要強(qiáng)力的化學(xué)方法來消除物體表面和溶液中的RNase。

避免RNase酶污染的來源

體液

體液中含有豐富的RNase活性。不戴手套會非常容易造成RNase污染，對關(guān)鍵實驗造成影響。在實驗過程中佩戴手套，經(jīng)常更換。一直穿著實驗服，避免衣物上的某些顆粒物質(zhì)掉入樣品。避免在氣流擾動的環(huán)境操作RNA。

槍頭與離心管

高質(zhì)量的耗材一般可視為不含RNase。不過，槍頭和離心管容易成為被忽視的RNase污染源。請確保從未開包的槍頭盒中取用槍頭，離心管也需來自未開包的。只進(jìn)行高壓滅菌操作無法破壞全部RNase活性，因為這些酶類耐受性強(qiáng)，降至室溫后又會重新恢復(fù)部分活性。必須使用經(jīng)過無RNase檢測并具有相關(guān)認(rèn)證的槍頭和離心管。

水與緩沖液

由于RNase無處不在，供水設(shè)備的來源及日常維護(hù)常導(dǎo)致分子生物學(xué)應(yīng)用中的水和緩沖液成為RNase污染的常見來源。焦碳酸二乙酯（DEPC）處理是滅活水和緩沖液中RNase最常用的方法。不過，包括Tris在內(nèi)的某些試劑不能使用DEPC進(jìn)行處理。

DEPC處理是消除水體、緩沖液及其他溶液中RNase污染最為常用的方法。DEPC能夠通過修飾RNase及其他蛋白中的-NH、-SH和-OH基團(tuán)來破壞酶的活性。處理步驟通常包括將溶液與0.1%的DEPC在室溫下共同孵育數(shù)小時——通常過夜——之后對溶液進(jìn)行高壓處理以去除殘余的DEPC。部分研究人員注意到在對DEPC處理的溶液進(jìn)行高壓滅菌之后，會嗅到一種果味的芳香氣味，便擔(dān)心這可能是未滅活的DEPC。其實這是由于高壓滅菌滅活DEPC過程中，產(chǎn)生了少量的乙醇。乙醇可能會與痕量的羧酸相結(jié)合，生成揮發(fā)性酯類從而散發(fā)出此種特殊氣味。這并不是DEPC未經(jīng)完全消除的信號，不會對后續(xù)反應(yīng)造成干擾。

含有伯胺基（如Tris）及一些含有仲胺或叔胺（如HEPES）的試劑不能使用DEPC進(jìn)行處理。胺基會與DEPC反應(yīng)并將其吸收，這樣就無法實現(xiàn)對RNase的滅活處理了。同時，對試劑中胺基的修飾也會影響其緩沖能力。對于只能進(jìn)行過濾除菌，而不能耐受高壓滅菌的溶液，如MOPS，也就不適合用DEPC來處理，因為高壓滅菌是滅活DEPC必不可少的步驟。

內(nèi)源性RNases

所有的組織樣品都含有內(nèi)源性的RNases。組織取樣后若不進(jìn)行直接處理（如RNA抽提等），常常需要用液氮迅速冷凍，這樣可使RNA的降解達(dá)到最少。

檢測RNase污染

緩沖體系、溶液

查找和確定RNase污染源常常是一項困難且耗時的工作。最為簡單但又最昂貴的解決方案是丟棄現(xiàn)有試劑并啟用全新批次的RNase-free試劑。另一個可選項是針對疑似污染溶液測試其中的RNase。

RNA樣品

RNase進(jìn)入RNA樣本可在多種情況下發(fā)生，如RNA分離時（少量RNase在RNA制備過程中引入），或日常取用時（會不可避免地需要重復(fù)開關(guān)樣品管并插入可能被污染的加樣槍頭）。RNase的污染通?？梢詮臉悠稲NA的降解看出來。

可于變性瓊脂糖凝膠中對總RNA樣本（2-5 μg）電泳分析，完整的總RNA樣本中28S與18S核糖體RNA條帶會顯示出2：1的信號強(qiáng)度比率。核糖體比值顯著低于2:1通常意味著發(fā)生了降解。

降解的RNA樣品不適于進(jìn)行Northern分析、RACE方案，或全長cDNA文庫的構(gòu)建。不過，除非樣本發(fā)生嚴(yán)重降解，反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR（RT-qPCR）的應(yīng)用中對于小擴(kuò)增子的分析一般不會受到影響。帶有某種程度降解的RNA樣品仍可進(jìn)行一些其它類型的分析，如二代測序。在某些類型的樣品（如福爾馬林固定，石蠟包埋(FFPE)樣本或儲存時間過久的樣本）中，RNA降解是不可避免的。

RNA儲存

痕量的RNase即會降低RNA的完整度，即使對冰凍儲存的液相樣本也是如此。短期保存時，可將RNA樣本重懸于RNase-Free水（加入0.1 mM EDTA）或TE緩沖液（10mM Tris，1 mM EDTA）并存儲于–80°C。

長期保存RNA的最佳方法是對預(yù)先分裝的樣本進(jìn)行鹽/酒精沉淀操作，并將此沉淀溶液保存于–80°C。低溫和酒精能夠有效抑制所有酶類的活性。比中性pH更低的酸堿度（添加醋酸鈉或醋酸銨）也有助于穩(wěn)定RNA。請注意，在進(jìn)行任意后續(xù)應(yīng)用前需先離心沉淀RNA并去除該儲存液。

低溫儲存

當(dāng)觀察到RNA的降解情況時，盡管RNase的污染是最為常見的推測，不過RNA分子在二價陽離子存在的加熱條件下其實也會發(fā)生鏈的斷裂，如在含有Mg2+或Ca2+離子的條件下，在>80°C的溫度下作用5分鐘RNA發(fā)生斷裂。因此，如需加熱RNA樣本，則最好在螯合劑存在的條件下進(jìn)行有效螯合二價陽離子，并用相對較低的pH值（6.4左右），能夠使RNA堿基的水解情況最小化。

作者：海星生物? ? ? ? ??

公眾號：Cas9X細(xì)胞基因編輯

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