3月27日，華大生命科學研究院徐訊研究員團隊在國際期刊Journal of Genetics and Genomics上發(fā)表了一篇綜述文章《Spatially resolved transcriptomics: a comprehensive review of their technological advances, applications, and challenges》，從技術特點、生物信息學工具和應用的角度詳細介紹了空間分辨轉錄組學（Spatially Resolved Transcriptomics，SRT）的最新進展和挑戰(zhàn)，以及具有代表性的SRT應用。華大生命科學研究院成夢南博士和博士生姜宇佳為第一共同作者，華大生命科學研究院徐訊研究員和劉龍奇研究員為共同通訊作者。該綜述為JGG時空組學?？恼?，以下是文章的詳細解讀。

探索生命奧秘的能力在很大程度上是由技術的創(chuàng)新和突破驅動的，從350年前顯微鏡的發(fā)明到近些年單細胞測序技術的出現(xiàn)，科學界已經能夠以前所未有的分辨率將生命可視化。近兩年，SRT技術革命性的出現(xiàn)和發(fā)展填補了探索生命奧秘背后空間甚至三維（three-dimensional，3D）組織分子基礎的空白，包括從全能細胞和人類疾病發(fā)展而來的不同細胞群的起源。

01：SRT技術研究進展

根據(jù)原理的不同，SRT技術在宏觀上可分為基于成像的和基于測序的兩類方法，這兩類技術的發(fā)展更新方向都是提高分辨率和捕獲能力（包括基因通量和捕獲效率），但是具體的實現(xiàn)策略有所區(qū)別。

其中，基于成像的SRT技術通過將顯色基團與探針相結合實現(xiàn)空間可視化，具有直接原位反映目的基因分布的優(yōu)勢。該方法的主要挑戰(zhàn)包括提高信號強度和增加基因檢測的數(shù)量。當前最具創(chuàng)新性和廣泛使用的基于成像的SRT方法是seqFISH（Sequential Fluorescence?In Situ?Hybridization）和MERFISH（Multiplexed error-robust fluorescence?In situ?hybridization）。

基于測序的SRT技術不需要先驗的基因序列知識，可以無偏倚地捕獲目標分子。該領域的空間分辨率和捕獲效率發(fā)展得非?？??；跍y序的SRT技術可進一步分為基于顯微切割的方法，如激光捕獲顯微鏡結合Smart-seq2（LCM-Seq）和GEO-Seq；基于原位測序的方法，如 STARmap、HybISS和STAPmap PLUS；基于原位空間條形碼的方法，如ST、Slide-seq / Slide-seqV2、HDST（High-Definition Spatial Transcriptomics） 、DBiT-seq、Stereo-seq（(SpaTial Enhanced REsolution Omics sequencing）等。

本文首先詳細描述了基于原位空間條形碼的方法的四個工作流程（“Carrier”設計；組織處理和RNA捕獲；逆轉錄和cDNA擴增；文庫的構建、序列分析和數(shù)據(jù)分析），總結了這類方法的主要技術挑戰(zhàn)：細胞分割、捕獲效率、空間分辨率、捕獲面積/吞吐量，并重點列舉比較了最新的基于微陣列、微流體、測序載體的原位空間條形碼技術特征，以指導研究人員針對不同的研究選擇合適的方法。

02：SRT技術、數(shù)據(jù)分析及其應用的發(fā)展與挑戰(zhàn)

在過去的幾年中，SRT技術取得了顯著的發(fā)展，但以下四個方面仍需要改進。

（1）mRNA的捕獲效率。與目前scRNA-seq技術的靈敏度相比，通過更高的捕獲能力得到更豐富的分子信息進行細致的細胞分類及亞型分類，目前仍是SRT技術的一個主要挑戰(zhàn)。

（2）空間分辨率。膨脹顯微鏡（expending?microscope，ExaM） 是一種利用可溶脹凝膠材料提高SRT技術空間分辨率的潛在技術。將高空間分辨SRT技術，如Seq-Scope和Stereo-seq，與ExaM相結合，空間分辨率將有望從500 nm進一步提高到100 nm甚至低于100 nm，這可能會帶來對生物學的新見解。

（3）樣本類型的普適性。目前的SRT技術大多適用于新鮮冷凍組織，不利于長期保存，而且在組織透化過程中容易發(fā)生變形和基因擴散。一些SRT技術可適用在福爾馬林固定石蠟包埋組織，但效果并不理想。而多聚甲醛 (paraformaldehyde，PFA) 包埋也是一種常見的組織保存方式，這可能有助于保存組織形態(tài)和原位RNA捕獲，具有更高的準確性和更少的擴散。

（4）空間多組學分析。獲得空間多組學，包括分子層面的基因表達、組織細胞層面的H&E染色，以及同一組織切片內的蛋白質分布，對于充分理解不同狀態(tài)的各種組織區(qū)域的基因表達譜非常重要。同時，SRT技術與其他傳統(tǒng)分子生物學技術的結合也是未來發(fā)展的一個重要領域。

與單細胞組學相比，高維空間分辨組學帶來了海量數(shù)據(jù)，因此對數(shù)據(jù)分析提出了巨大挑戰(zhàn)。在此，該文總結了高分辨率SRT分析中關鍵環(huán)節(jié)的工具和挑戰(zhàn)。其中，數(shù)據(jù)分析工具包括用于空間矩陣生成、圖像配準和細胞分割、SRT和單細胞數(shù)據(jù)集集成、基因插補和細胞通訊分析的方法。數(shù)據(jù)分析中需要解決的挑戰(zhàn)包括跨切片的數(shù)據(jù)配準、消除批次效應、數(shù)據(jù)規(guī)范化和填補切片之間的信息空白。其他挑戰(zhàn)有整合空間轉錄組學與其他多模態(tài)數(shù)據(jù)、如何識別具有基因表達模式和組織學特征一致性的空間域、如何整合來自通過不同切片處理的多個（而非單個）相鄰組織的SRT數(shù)據(jù)等。

SRT已廣泛應用于許多前沿領域，在空間分辨率水平上構建了跨多個物種多個組織的基因表達圖譜。最吸引人的一個領域是在毫米到厘米的尺度上重建胚胎發(fā)育的時空轉錄組學圖譜。如，通過Stereo-seq，利用小鼠、斑馬魚、果蠅等典型模式動物，繪制了胚胎發(fā)育的時空基因表達圖譜。這些研究探索了與發(fā)育事件相關的空間細胞分辨率的發(fā)育軌跡和細胞-細胞相互作用。

第二個研究方向是在分子和細胞分辨下重建3D器官。如，利用Stereo-seq獲得了食蟹猴大腦3D空間分辨細胞類型圖譜，其中最大單張切片面積達到5 cm x 3 cm，可在全腦尺度上研究細胞分布異質性和功能。

第三個研究方向是針對疾病機制的研究。隨著高分辨率SRT技術的進步，腫瘤邊界和微環(huán)境可以在分子水平上被定位和定義。

SRT 技術的另一個有趣應用是在空間分辨率下研究植物的細胞景觀。近期，通過Stereo-seq，根據(jù)空間信息區(qū)分了擬南芥葉片的細胞亞型，證實了高分辨率SRT為植物生物學帶來新發(fā)現(xiàn)的能力。

總之，SRT技術可以將宏觀與微觀生命信息相結合，以補充和/或為現(xiàn)有研究提供新見解，或激發(fā)有關空間維度的新研究。隨著SRT技術的不斷優(yōu)化、更新迭代和成本下降，未來SRT有望成為基礎科學和轉化醫(yī)學的基礎工具，全面應用于3D器官重建、胚胎發(fā)育和再生、生命演化、疾病研究等各個領域，并掀起生命科學研究的新一代浪潮。