粥樣硬化型心血管疾?。ˋtherosclerotic cardiovascular disease，CVD)是當前人類面臨的主要致死性疾病之一，也是當前心血管疾病研究熱點，動物實驗是研究和探索治療心血管疾病途徑必不可少的環(huán)節(jié)。

常見動脈粥樣硬化動物模型包括Apoe敲除小鼠、Ldlr敲除小鼠、在其基礎上調(diào)控其他基因的品系以及其他基因調(diào)控方式調(diào)控相關基因的動物模型（表1）。

表1.不同動脈粥樣硬化小鼠對比

Pcsk9在動脈粥樣硬化模型小鼠中的應用

轉基因動脈粥樣硬化模型小鼠在是實驗上存在一定的限制，如沒有相關課題時需要一直保種飼養(yǎng)，隨后，大量繁殖集齊數(shù)量足夠年齡相近的小鼠也需要時間，近年來，科學家們建立了一種快速、簡便、通用和經(jīng)濟有效的、利用病毒注射野生型小鼠的造模方式： AAV9-Pcsk9尾靜脈注射。

Pcsk9過表達是近幾年新出現(xiàn)的動脈粥樣硬化急性模型之一。前蛋白轉化酶枯草溶菌素轉化酶9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, Pcsk9）主要由肝臟表達，介導一些受體的降解，在膽固醇和脂肪酸的代謝中起到重要作用。

Pcsk9能與肝細胞表面低密度脂蛋白受體 (low density lipoprotein receptor, LDLR) 結合, 構成復合物并靶向轉運到溶酶體內(nèi)進行降解, 從而阻斷LDLR在細胞膜表面的循環(huán)途徑, 抑制低密度脂蛋白膽固醇 (low density lipoproteincholesterol, LDL-C) 通過LDLR轉運從體內(nèi)清除代謝, 使得血漿中LDL-C升高, 最終導致動脈粥樣硬化 (atherosclerosis, AS) 的形成。過表達突變的Pcsk9，能加速LDLR的降解，嚴重影響血漿中LDL-C的清除能力，最終導致高脂血癥。因此我們利用這原理，以AAV作為過表達Pcsk9的載體，使用APOE的啟動子確保能在肝臟中特異表達，誘導野生型小鼠產(chǎn)生動脈粥樣硬化，AAV結構如圖1所示。

圖1. AAV9-Pcsk9示意圖

該模型的構建方法也十分簡單,AAV病毒進入循環(huán)系統(tǒng)后能傾向于在肝臟中富集，因此，病毒的遞送至肝臟十分簡單。構建模型時，野生型C57小鼠通過尾靜脈注射即可構建成功。

該產(chǎn)品使用的APOE啟動子是肝臟載脂蛋白的增強子嵌合抗胰蛋白酶的啟動子構成的肝臟特異啟動子ApoEHCR-hAAT，可以確保病毒的作用局限于肝臟細胞，防止Pcsk9作用其他細胞產(chǎn)生實驗的干擾。配合漢恒高滴度的純化技術，病毒滴度可達到1*10^v.g./ml，在保證注射的病毒顆粒數(shù)量同時極大的減少尾靜脈注射的體積，減少動物的傷害。

總之，這種方法構建的動物模型十分簡便，見效快，而且效果能維持很久，不需要繁瑣耗時的轉基因小鼠的配種，極大地縮減了實驗流程。

AAV9-Pcsk9注射誘導動脈模型的詳細流程：

? 1. 小鼠飼養(yǎng)：

小鼠的飼養(yǎng)應在SPF的級別或其他學術界公認的條件下飼養(yǎng)，必須經(jīng)由有關專業(yè)培訓的飼養(yǎng)員管理。

整個實驗流程小鼠應處在穩(wěn)定受控的培養(yǎng)條件，包括21°±2°C, 50%±10%相對濕度，12小時光照和12小時黑暗循環(huán)飼養(yǎng)。

小鼠在手術前一周能隨意獲取,并有充足的標準的飼料；

? ?2. AAV注射

每只小鼠尾靜脈注射1X10v.g.以上總量的PCSK9過表達病毒或?qū)φ詹《?，使用生理鹽水將兩種病毒稀釋為相同體積，且總體積不能超過150μl，注射后使用WD飼料或Paigen飼料飼養(yǎng)12周左右；

Pcsk9過表達AAV現(xiàn)貨供應

漢恒生物擁有人源、鼠源Pcsk9突變體過表達腺相關病毒（AAV9-CMV/APOE-Pcsk9），供動脈粥樣硬化研究者造模使用，現(xiàn)貨供應，質(zhì)量有保證。

1、Schulz R, Schlüter KD, Laufs U.Molecular and cellular function of the proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) [J].Basic Res Cardiol, 2015, 110 (2) :1-19.

2、Seidah NG, Sadr MS, Chrétien M, et al.The multifaceted proprotein convertases:their unique, redundant, complementary, and opposite functions[J].J Biol Chem, 2013, 288 (30) :21473-21481.

3、Kumar S, Kang DW, Rezvan A, Jo H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 2017;97(8):935-945.

小提示：

使用AAV9-Pcsk9-D377Y構建動物模型可以選擇聯(lián)合部分頸動脈結扎術（PCL），快速誘導斑塊的形成，雖然說動脈粥樣硬化是是多種因素共同誘導的疾病，但是血流紊亂區(qū)域常常是動脈粥樣硬化開始發(fā)展的地方。這樣也使得小鼠的病變的位置變得可控，對模型的影響更加單一，減少其他因素的影響。部分頸動脈結扎引起的動脈粥樣硬化的分子機制與人動脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)域(如主動脈弓小曲)觀察到的分子機制也是相同的。一般在病毒注射一周后，小鼠接受PCL手術（具體流程參考文獻PMID: 20613706），術后小鼠繼續(xù)HDF飼養(yǎng)3周后取材，評估研究對象對動脈粥樣硬化的影響。