抗衰老科學(xué)在國內(nèi)升溫、引發(fā)全民關(guān)注，少不了兩股東風(fēng)：一股NAD+，一股二甲雙胍。（自二甲雙胍從天然草藥山羊豆中被發(fā)現(xiàn)，今年胍胍正好百歲了?。?/p>

如果說NAD+的疑云密布在補充方式、前體的酶解與轉(zhuǎn)化效率上，二甲雙胍這個問世80余年的老藥，出人意料地，連起效機制都還未明晰。

我們曾對二甲雙胍作用機制進行階段性小結(jié)，大部分觀點同意二甲雙胍主要健康益處與AMPK激活有關(guān)，但是具體怎么激活A(yù)MPK？沒人說得準(zhǔn)。

二甲雙胍激活A(yù)MPK之謎

簡單羅列一下AMPK的激活原理，AMPK由α、β、γ三大亞基構(gòu)成，每個亞基又分為多個結(jié)構(gòu)域。最經(jīng)典的AMPK激活方式是：當(dāng)細胞內(nèi)AMP增多時， LKB1（肝激酶 B1）被激活，它可以直接磷酸化AMPK的α亞基Thr172位點（蘇氨酸172），激活A(yù)MPK；AMP增多也可通過直接結(jié)合γ亞基CBS區(qū)域變構(gòu)激活A(yù)MPK。

圖注：AMPK結(jié)構(gòu)示意圖

除該經(jīng)典方式，AMPK還有以下幾種活化方式：

①ADaM位點可被水楊酸鹽或一些人造化合物激活，從而輕微上調(diào)AMPK活性（見上右圖ADaM位點）；

②在基因損傷壓力下，細胞中鈣離子增高，可通過CaMKK2信號活化AMPK；

③細胞葡萄糖不足時，醛縮酶Aldolase引發(fā)溶酶體表面V-ATPase變構(gòu)，又刺激到LKB1與AMPK接觸，從而使Thr172磷酸化、AMPK活化。

二甲雙胍通過上述哪種方式激活A(yù)MPK？

2000-2010年若干論文聲援了“二甲升高AMP，走最經(jīng)典激活通路”的說法，使其成為主流猜想。就既有研究結(jié)論看，動物實驗需按照240mg/kg大劑量給藥，才會抑制呼吸鏈復(fù)合體I、減少ATP。雖然即使人類每天口服1.5-2.0g二甲雙胍，其引發(fā)的血藥濃度最大值波動在5-30μM，遠低于240mg/kg動物給藥的125-150μM，但仍有不少抗衰老愛好者擔(dān)心每天口服二甲雙胍會損傷線粒體、得不償失。

圖注：線粒體氧化呼吸（來源：cusabio.com）

上周，“吃胍”群眾們的心總算被廈門大學(xué)林圣彩院士發(fā)表于Nature正刊的論文安撫放下了。在人人都想來片二甲延壽的今天，本文可謂正能量滿滿：首次以常規(guī)口服劑量二甲雙胍作研究對象，深入揭秘起效原理，低劑量二甲雙胍只在細胞內(nèi)小規(guī)模激活A(yù)MPK，不干擾ATP生成，且仍發(fā)揮降糖減脂、抗衰延壽益處。

低劑量二甲雙胍激活A(yù)MPK，

但不抑制ATP

研究伊始，林圣彩團隊首先自證口服“臨床二甲雙胍治療劑量”的吸收情況。他給予臨床受試者500mg格華止??緩釋片（派派掐指一算，這是讀者朋友們相對容易接受的劑量），定點抽血測定受試者體內(nèi)的藥物濃度，發(fā)現(xiàn)口服格華止3小時即可在血液中達到藥物濃度峰值（差不多4μM），12小時又逐漸趨于平靜。

圖注：服用500mg格華止緩釋片后人體血藥濃度變化

接下來，研究團隊在離體細胞模擬500mg格華止??給藥，正式進入低劑量二甲雙胍作用機制的勘測之旅。他們用5μM二甲雙胍“浸泡”哺乳動物肝原代細胞（可理解為“從肝臟直接取下的新鮮細胞”），果不其然，肝細胞的AMPK在用藥2小時起就被激活（下圖左），但細胞內(nèi)ATP、AMP、ADP比值卻無明顯變化（下圖右），這與大劑量給藥截然不同。此外他們還觀察到一個有趣現(xiàn)象：細胞溶酶體發(fā)生了脫羧反應(yīng)，這暗示低劑量二甲雙胍起效很可能與溶酶體有關(guān)。

圖注：細胞內(nèi)的溶酶體

脫羧反應(yīng)常發(fā)生于體系pH升高時，這使研究人員將目光投向溶酶體表面名為V-ATPase質(zhì)子泵，它負責(zé)將溶酶體pH維持在4.5到6.5。經(jīng)驗證，低劑量二甲雙胍處理溶酶體僅需1小時，V-ATPase的活性就大幅下降(下圖左)，其質(zhì)子交換能力也被抑制（下圖右）。

圖注：（+）表示使用二甲雙胍，

（-）表示未使用二甲雙胍

發(fā)現(xiàn)二甲雙胍全新靶蛋白PEN2

二甲雙胍抑制溶酶體ATPase在先，激活A(yù)MPK在后，三者如何在給藥后互相“接頭”？

研究團隊設(shè)計了一種二甲雙胍“探針”MET-P1，它可像釣魚一樣釣出與二甲雙胍結(jié)合的蛋白。既然二甲雙胍激活A(yù)MPK得經(jīng)過溶酶體，那就把釣魚范圍鎖定在溶酶體。在純化溶酶體內(nèi)所有蛋白提取物后，探針從中薅出了113種蛋白；使用慢病毒介導(dǎo)的shRNA讓這100多種蛋白質(zhì)“消失”，發(fā)現(xiàn)當(dāng)缺失了名為PEN2的蛋白，二甲雙胍就不能再抑制溶酶體V-ATPase活性，AMPK也無法隨之激活。

圖注：MET-P1探針在純化的溶酶體蛋白中“釣魚”

PEN2就是低劑量二甲雙胍激活A(yù)MPK的必備蛋白，通過進一步質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)二甲與PEN2的準(zhǔn)確結(jié)合位置在PEN2的F35、E40位點。

至此，全新的二甲雙胍靶蛋白被發(fā)現(xiàn)了。

PEN2到底是什么東西？

PEN2（早老素增強因子-2），是γ-分泌酶復(fù)合物的一個基團，日常參與的工作可謂“如雷貫耳”、“令人發(fā)指”：將名為APP的淀粉樣前體蛋白催化水解為Aβ淀粉樣蛋白，助推老年癡呆發(fā)生發(fā)展。

圖注：γ分泌酶是跨膜蛋白，

PEN2（紅）為一個組成部分

這么看來，“接應(yīng)”二甲雙胍不是PEN2的天性，大概只能算“兼職”。

低劑量二甲雙胍激活A(yù)MPK，

竟與葡萄糖饑餓“殊途同歸”

發(fā)現(xiàn)低劑量二甲雙胍的全新靶蛋白已經(jīng)令人興奮，為厘清AMPK活化前每一個步驟，研究團隊繼續(xù)深挖溶酶體V-ATPase如何被“二甲雙胍、PEN2”組合影響。通過質(zhì)譜分析等技術(shù)，篩選出123種與PEN2發(fā)生關(guān)系、常駐溶酶體中的蛋白，最終成功鎖定V-ATPase的輔助蛋白ATP6AP1，它的420-440氨基酸殘基正是與PEN2與V-ATPase結(jié)合的位點。

至此我們獲得的結(jié)論是：低劑量二甲雙胍與PEN2結(jié)合，二者一起募集到溶酶體V-ATPase復(fù)合體的ATP6AP1蛋白上，即可導(dǎo)致V-ATPase空間構(gòu)象發(fā)生改變，V-ATPase活性被抑制。

圖注：PEN2與ATP6AP1結(jié)合

（紅色虛線圈出結(jié)合位點）

V-ATPase活性被抑制，最終為何輪到AMPK被激活？

在溶酶體表面，V-ATPase質(zhì)子泵與名為Ragulator的蛋白結(jié)合在一起，共負責(zé)感應(yīng)細胞內(nèi)營養(yǎng)、能量短缺或充足。當(dāng)營養(yǎng)充足時，V-ATPase活性良好，呈下圖左“盛開模樣”，這種空間構(gòu)象有助于mTORC1復(fù)合體募集Ragulator，激活mTOR信號，讓細胞進行合成代謝；當(dāng)能量短缺時，V-ATPase活性被抑制，呈下圖右“收縮模樣”，這種空間構(gòu)象有利于把LKB1募集到溶酶體膜，接觸并激活A(yù)MPK，讓細胞進行分解代謝。

圖注：V-ATPase與Ragulator在溶酶體表面調(diào)控AMPK、mTOR。為方便閱讀，本推文不格外對溶酶體(lysosome)/內(nèi)體（endosome）作區(qū)分

因為V-ATPase-Ragulator感應(yīng)器周圍的“空間有限”,mTOR、LKB1只能有一種“落座”，這注定了AMPK、mTOR當(dāng)下的活化/抑制狀態(tài)是對立的。研究團隊對低劑量二甲雙胍→PEN2→ ATP6AP1→V-ATPase → Ragulator → LKB1 → AMPK進行環(huán)環(huán)驗證，也確認二甲就是借用PEN2這個“中介”搭上了溶酶體活化AMPK、抑制mTOR的列車。

林院士通過探索二甲雙胍作用機制，引出了AMPK活化的全新分支路徑。看到這里的朋友或許可以回頭看本文開頭，AMPK活化機制中“葡萄糖饑餓”也是經(jīng)過V-ATPase→Ragulator→LKB1→AMPK來調(diào)控AMPK、mTOR活性——這條溶酶體激活路徑并不是某種物質(zhì)專屬，是一條進化保守的代謝調(diào)節(jié)路徑，更可能是AMPK很青睞的激活路徑（而不是“備胎”）。

令人敬佩的是，這條正變得越來越“經(jīng)典”的AMPK活化路徑，也是林院士團隊發(fā)現(xiàn)的。相關(guān)研究最早于2014年發(fā)表于Cell Metabolism雜志，彼時破除了人們 “葡萄糖不足則ATP不足，從而由AMP經(jīng)典通路激活A(yù)MPK”的猜測，不僅被評為2017年度“中國生命科學(xué)十大進展”，“V-ATPase→Ragulator→LKB1→調(diào)控AMPK、mTOR活性”甚至被國際學(xué)者命名為“林通路”。

圖注：二甲雙胍、葡萄糖饑餓均共享“林通路”激活A(yù)MPK

至此我們對低劑量二甲雙胍起效機制進行小結(jié)：低劑量二甲雙胍，享有全新靶蛋白PEN2，在PEN2的幫助下進入“林通路”激活A(yù)MPK，該過程而不需要抑制ATP生成；且與葡萄糖饑餓、熱量限制“殊途同歸”。

論文正文分享到此告一段落，細細回味方才察覺其中正能量。

首先，它平息了常規(guī)口服劑量二甲雙胍激活A(yù)MPK的原理爭議，不僅排除了損傷ATP合成的憂患，甚至找到了全新靶蛋白PEN2，毋庸置疑是一項偉大的開創(chuàng)工作。

其次，二甲雙胍經(jīng)PEN2匯入“林通路”，也從深層論證了“二甲雙胍是優(yōu)秀的熱量限制模擬物”這一觀點，AMPK激活劑有很多，想必二甲雙胍正是因?qū)崃肯拗频母叨饶M特性，才能在健康功效上冠絕群雄吧。

再者，我們不得不感嘆本文用心之良苦，全文圍繞“低劑量”，而該劑量的設(shè)定（約等于口服500mg格華止??），對時光派讀者而言可謂非?！百N心”。

最后，PEN2的發(fā)現(xiàn)有助于人們開發(fā)二甲雙胍的更優(yōu)替代品。二甲雙胍需要OCT蛋白轉(zhuǎn)運入胞，然而OCT蛋白僅在肝臟、小腸、腎臟富集，因此“神藥”藥效很大程度被局限于這些臟器中。如能篩選或從頭合成瞄準(zhǔn)PEN2、ATP6AP1蛋白的新分子，則有望開發(fā)新的、靶器官更廣泛的AMPK激活劑，做出全身逆齡的“強效不老藥”。

距離論文發(fā)表已經(jīng)過去幾天，不少平臺都進行了搬運與點評，但時光派還是想與各位讀者分享自己閱讀此文時的激動心情。我們想對所有攻堅衰老與抗衰老機制的偉大學(xué)者致敬，做別人難以做到的深度研究，或許需要更辛勤的工作、耗費更長時間，但無疑也會給全人類帶來更大的進步和希望！

作為重要的調(diào)節(jié)壽命信號通路，AMPK通路如何構(gòu)成？對機體穩(wěn)態(tài)作用幾何，我們該如何去科學(xué)調(diào)控？

時光派為廣大讀者精心錄制了最全面、細致的AMPK科普，無論是抗衰領(lǐng)域的小白，還是有一定基礎(chǔ)的老玩家，都能從中有所收獲！專欄內(nèi)更有全球頂尖抗衰研究者、人類長壽基因發(fā)現(xiàn)者Nir Barzilai博士和衰老九大標(biāo)識提出者、端粒領(lǐng)域絕對權(quán)威Maria Blasco博士帶來的大咖課程。

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