【菜鳥(niǎo)博士技術(shù)景觀】分子診斷技術(shù)全解析

分子診斷技術(shù)是用分子生物學(xué)方法針對(duì)人體及各種病原體的遺傳物質(zhì)的表達(dá)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，從而達(dá)到預(yù)測(cè)及診斷疾病的目的。
近年來(lái)，隨著分子診斷技術(shù)的升級(jí)迭代，分子診斷的臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛和深入，分子診斷市場(chǎng)進(jìn)入快速發(fā)展期。
筆者總結(jié)市場(chǎng)上常見(jiàn)的分子診斷技術(shù)，分為上中下三篇，上篇介紹PCR技術(shù)，中篇介紹核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，下篇介紹測(cè)序技術(shù)。
01
上篇：PCR技術(shù)
PCR技術(shù)
PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是體外DNA擴(kuò)增技術(shù)之一，至今已經(jīng)超過(guò)30年的歷史。
PCR技術(shù)于1983年由美國(guó)Cetus公司的KaryMullis首創(chuàng)，1985 年Mullis申請(qǐng)了PCR專(zhuān)利，同年在Science上發(fā)表了第一篇PCR 學(xué)術(shù)論文，1993 年Mullis因此獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
PCR基本原理
PCR可以將目標(biāo)DNA片段擴(kuò)增一百萬(wàn)倍以上，其原理是在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。

標(biāo)準(zhǔn) PCR 過(guò)程分為三步：
1.變性（Denaturation）：利用高溫使DNA 雙鏈分離。DNA雙鏈之間的氫鍵在高溫下（93- 98℃）被打斷。
2.退火（Annealing）：在 DNA 雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA 上。
3.延伸（Extension）：DNA 聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物處開(kāi)始沿著DNA 鏈合成互補(bǔ)鏈，延伸完成，則完成一輪循環(huán)，DNA片段數(shù)增加一倍。
往復(fù)循環(huán)這三個(gè)步驟25-35 次，DNA 片段數(shù)將得到指數(shù)級(jí)增加。

PCR的巧妙之處在于針對(duì)不同的目標(biāo)基因可以設(shè)計(jì)不同的引物，使目標(biāo)基因片段在短時(shí)間內(nèi)得到百萬(wàn)級(jí)的放大。
目前為止，PCR可以分為三類(lèi)，分別是普通PCR、熒光定量PCR和數(shù)字PCR。
第一代普通PCR
采用普通PCR 擴(kuò)增儀來(lái)對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，只能做定性分析。
第一代PCR主要缺點(diǎn)：
容易發(fā)生非特異性擴(kuò)增和假陽(yáng)性結(jié)果。
檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣。
只能做定性檢測(cè)。
第二代熒光定量PCR
熒光定量PCR（Real-Time PCR），也叫做qPCR，通過(guò)在反應(yīng)體系中加入能夠指示反映進(jìn)程的熒光探針，通過(guò)熒光信號(hào)的積累來(lái)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的積累，通過(guò)熒光曲線(xiàn)來(lái)判斷結(jié)果，并可以借助Cq 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)定量。
qPCR 技術(shù)由于操作過(guò)程在封閉體系中進(jìn)行，降低了污染概率，并且可以通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)從而進(jìn)行定量檢測(cè)，因此臨床應(yīng)用最為廣泛，已成為PCR中的主導(dǎo)技術(shù)。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為：TaqMan熒光探針、分子信標(biāo)和熒光染料。
1)TaqMan熒光探針：
PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。
探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
2)SYBR熒光染料：
在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過(guò)溶解曲線(xiàn)，確定PCR反應(yīng)是否特異。

3)分子信標(biāo)
是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。

PCR產(chǎn)物生成后，退火過(guò)程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。

第二代PCR主要缺點(diǎn)：
靈敏度還有欠缺，低拷貝標(biāo)本檢測(cè)不準(zhǔn)確。
存在背景值影響，結(jié)果易受干擾。
當(dāng)反應(yīng)體系中有PCR抑制物時(shí)，檢測(cè)結(jié)果易受干擾。
第三代數(shù)字PCR
數(shù)字PCR（DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR）通過(guò)終點(diǎn)檢測(cè)計(jì)算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，無(wú)需采用內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可進(jìn)行精確的絕對(duì)定量檢測(cè)。
數(shù)字PCR采用終點(diǎn)檢測(cè)，不依賴(lài)于Ct值（循環(huán)閾值），所以數(shù)字PCR反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響降低，對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力提高，具有很高的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。
由于具備高靈敏度、高精確度的特點(diǎn)，不易被PCR反應(yīng)抑制劑干擾，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品可實(shí)現(xiàn)真正意義的絕對(duì)定量，而成為研究和應(yīng)用熱點(diǎn)。
根據(jù)反應(yīng)單元的不同形式，主要可分為微流體式、芯片式和微滴式三大類(lèi)系統(tǒng)。
1)微流體數(shù)字PCR，Microfluidic digital PCR，mdPCR。
基于微流控技術(shù)，對(duì)DNA模板進(jìn)行分液，微流控技術(shù)能實(shí)現(xiàn)樣品納升級(jí)或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再與PCR反應(yīng)體系結(jié)合，mdPCR已逐漸被其他方式取代。
2)微滴數(shù)字PCR，Droplet-based digital PCR，ddPCR。
利用油包水微滴生成技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。
以伯樂(lè)的ddPCR為例，主要包括三個(gè)步驟：

第一，準(zhǔn)備樣本和生成微滴，如下圖，8x3的微孔板，一排加樣本，一排加油滴，通過(guò)微滴生成器每個(gè)樣本生成20000個(gè)微滴。

第二，進(jìn)行“油包水”P(pán)CR，把微孔板放入PCR擴(kuò)增儀，對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行40個(gè)熱循環(huán)的PCR反應(yīng)。

第三，讀取微滴結(jié)果，把微孔板放入讀取儀，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)獲取每個(gè)微滴PCR終點(diǎn)結(jié)果的熒光信號(hào)，并用泊松分布原理糾正結(jié)果。

Bio-rad去年上市的Bio-Rad QX ONE數(shù)字PCR系統(tǒng)整合了微滴生成、熱循環(huán)反應(yīng)及微滴讀取等步驟，最大程度減少人工操作。
配備四個(gè)獨(dú)立的熒光檢測(cè)通道，結(jié)合ddPCR特有的高階多重PCR技術(shù)，可以在單反應(yīng)孔中實(shí)現(xiàn)8重拷貝數(shù)變異(CNV)檢測(cè)、5重突變檢測(cè)或4重基因表達(dá)檢測(cè)。

3)芯片數(shù)字PCR，Chip-baseddigital PCR，cdPCR。
利用集成流體通路技術(shù)在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，通過(guò)不同的控制閥門(mén)控制溶液在其中的流動(dòng)，將樣本液體分成大小一致的納升級(jí)于反應(yīng)孔種進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。
以法國(guó)Stilla technologies 公司的cdPCR技術(shù)為例，主要包括以下步驟：
第一，加樣和生成微滴：將樣本和PCR反應(yīng)液加入微流控芯片，放入儀器中，儀器可通過(guò)物理方法生成單層平鋪的20000~30000個(gè)微滴陣列。
第二，對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行PCR擴(kuò)增：在Naica Geode微滴生成擴(kuò)增系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
第三，讀取和分析結(jié)果：將芯片置于Prism微滴讀取分析系統(tǒng)上進(jìn)行熒光信號(hào)采集，計(jì)數(shù)陰陽(yáng)性微滴，通過(guò)泊松分布計(jì)算獲得靶標(biāo)基因絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。

總結(jié)一下，將樣本和PCR反應(yīng)液加入微流控芯片，放入儀器中，通過(guò)物理方法生成單層平鋪的微滴陣列，隨后對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行六通道熒光信號(hào)采集，計(jì)數(shù)陰陽(yáng)性微滴，通過(guò)泊松分布計(jì)算獲得靶標(biāo)基因絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。
第三代PCR主要缺點(diǎn)：
儀器和試劑昂貴。
模板質(zhì)量要求較高，模板量超過(guò)微體系量將導(dǎo)致無(wú)法定量，過(guò)少則定量準(zhǔn)確度降低。
當(dāng)存在非特異性擴(kuò)增時(shí)也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性。
PCR的各種延伸技術(shù)
1.遞減PCR（touchdown PCR）：前幾循環(huán)溫度逐漸下降。
2.逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）：以由mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來(lái)的cDNA 為模板，也因?yàn)槭菑谋憩F(xiàn)型基因來(lái)進(jìn)行增量的，由此產(chǎn)生出來(lái)的cDNA 產(chǎn)物不帶有內(nèi)含子（基因中不具意義的段落），常應(yīng)用于分子克隆技術(shù)。
3.熱啟動(dòng)PCR（hotstart PCR）：以高熱激活型核酸聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，減少非專(zhuān)一性產(chǎn)物。
4.巢式PCR（nested PCR）：先用低特異性引物擴(kuò)增幾個(gè)循環(huán)以增加模板數(shù)量，再用高特異性引物擴(kuò)增。
5.多重PCR（multiplex PCR）：在同一個(gè)管中使用多組引物。
6.復(fù)原條件PCR（reconditioning PCR）：PCR 產(chǎn)物稀釋 10 倍后重新放入原濃度的引物和dNTP 等循環(huán) 3 次，以消除產(chǎn)物中的異二聚體。
7.dsRNA 合成（dsRNA replicator）：合并使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA聚合酶與Phi6 RNA replicase；從雙股 DNA轉(zhuǎn)錄為對(duì)應(yīng)的雙股RNA（dsRNA）?？蓱?yīng)用于RNAi實(shí)驗(yàn)操作。
8.COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature PCR):用以檢測(cè)突變或特殊等位基因的PCR 應(yīng)用技術(shù)。
參考文獻(xiàn)：
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3.G.Terrance Walker,etc.Strand displacement amplification-an isothermal, in vitro DNA amplification technique
3.各公司官網(wǎng)
02
中篇：核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)
本篇介紹一下等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。
PCR是使用最為廣泛的核酸擴(kuò)增技術(shù)，以其靈敏性、特異性得到廣泛應(yīng)用，然而PCR需要反復(fù)的熱變性，無(wú)法擺脫依賴(lài)儀器設(shè)備的局限，從而限制了其在臨床現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的應(yīng)用。
自20世紀(jì)90年代初，很多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始發(fā)展無(wú)需熱變性的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、鏈替代等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、依賴(lài)核酸序列等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等技術(shù)。
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本榮研公司的Notomi等于2000年首先提出來(lái)的新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。
基于該技術(shù)，榮研還曾和國(guó)內(nèi)某公司引起專(zhuān)利糾紛。
其擴(kuò)增原理是基于DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈。
DNA在此溫度下利用4條特異性引物依靠一種鏈置換DNA聚合酶，使鏈置換DNA的合成不停地自我循環(huán)。
先確定目標(biāo)基因上的6個(gè)特異性區(qū)域F3、F2、F1、B1、B2、B3，然后依據(jù)這6 個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物（如下圖）：
正向內(nèi)引物(forwardinner primer，F(xiàn)IP)，由F1c 和F2 組成。
反向內(nèi)引物(backwardinner primer，BIP)，由B1c 和B2 組成，中間均以TTTT作為間隔。
外引物F3、B3 分別由目的基因上的F3、B3 區(qū)域組成。

在LAMP 反應(yīng)體系中，內(nèi)引物的濃度幾倍于外引物的濃度。內(nèi)引物先與模板鏈結(jié)合合成互補(bǔ)鏈，形成DNA雙鏈。隨后外引物再與該模板鏈結(jié)合，形成DNA雙鏈，在BstDNA 聚合酶的作用下，釋放出由內(nèi)引物合成的互補(bǔ)鏈，該互補(bǔ)鏈經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)最終形成具有啞鈴結(jié)構(gòu)的DNA單鏈。
以啞鈴結(jié)構(gòu)DNA單鏈自身為模板不斷形成一端開(kāi)口的過(guò)渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA，由內(nèi)外引物引導(dǎo)過(guò)渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA不斷發(fā)生鏈置換延伸反應(yīng)，最后形成具有多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度不一的DNA混合物。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的優(yōu)勢(shì)與不足
LAMP 的優(yōu)勢(shì)：
（1）擴(kuò)增效率高，能夠在1h內(nèi)有效的擴(kuò)增1-10個(gè)拷貝的目的基因，擴(kuò)增效率為普通PCR的10 倍-100 倍。
（2）反應(yīng)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，不需要特殊的設(shè)備。
LAMP 的不足：
（1）對(duì)引物的要求特別高。
（2）擴(kuò)增產(chǎn)物不能用于克隆測(cè)序，只能用于判斷。
（3）由于其敏感性強(qiáng)，容易形成氣溶膠，造成假陽(yáng)性，影響檢測(cè)結(jié)果。
鏈置換擴(kuò)增
鏈置換擴(kuò)增（strand displacement amplification,SDA）是美國(guó)學(xué)者Walker于1992年首次提出的一種基于酶促反應(yīng)的DNA體外等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。
SDA 的基本系統(tǒng)包括一種限制性核酸內(nèi)切酶、一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶、兩對(duì)引物、dNTP以及鈣、鎂離子和緩沖系統(tǒng)。
鏈置換擴(kuò)增其原理是基于在靶DNA兩端帶有被化學(xué)修飾的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列，核酸內(nèi)切酶在其識(shí)別位點(diǎn)將鏈DNA打開(kāi)缺口，DNA聚合酶延伸缺口3’端并替換下一條DNA鏈。
被替換下來(lái)的DNA單鏈可與引物結(jié)合并被DNA聚合酶延伸成雙鏈。該過(guò)程不斷反復(fù)進(jìn)行，使靶序列被高效擴(kuò)增。

鏈置換擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與不足
SDA 的優(yōu)點(diǎn)：
擴(kuò)增效率高，反應(yīng)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，不需要特殊的設(shè)備。
SDA 的不足：
產(chǎn)物不均一，在SDA循環(huán)中總要產(chǎn)生一些單、雙鏈產(chǎn)物，用電泳法檢測(cè)時(shí)必然會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。
滾環(huán)核酸擴(kuò)增
滾環(huán)核酸擴(kuò)增（rolling circle amplification, RCA）是通過(guò)借鑒病原生物體滾環(huán)復(fù)制DNA的方式而提出的，指在恒溫下以單鏈環(huán)狀DNA為模板，在特殊的DNA聚合酶（比如Phi29）的作用下，進(jìn)行滾環(huán)式DNA合成，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的擴(kuò)增。
RCA可分為線(xiàn)性擴(kuò)增與指數(shù)擴(kuò)增兩種形式，線(xiàn)性RCA的效率可達(dá)到105倍，而指數(shù)RCA的效率可達(dá)到109倍。
簡(jiǎn)單區(qū)分，如下圖，線(xiàn)性擴(kuò)增a只用1條引物，指數(shù)擴(kuò)增b則有2條引物。

線(xiàn)性RCA 又稱(chēng)為單引物RCA，一條引物結(jié)合到環(huán)狀DNA上，在DNA 聚合酶作用下被延伸，產(chǎn)物為單環(huán)長(zhǎng)度數(shù)千倍的大量重復(fù)序列的線(xiàn)狀單鏈。
由于線(xiàn)性RCA的產(chǎn)物始終連接在起始引物上，所以信號(hào)易于固定是它的一大優(yōu)勢(shì)。
指數(shù)RCA，也被稱(chēng)作超分支擴(kuò)增HRCA(Hyper branched RCA)，在指數(shù)RCA中，一條引物擴(kuò)增出RCA產(chǎn)物，第二條引物與RCA產(chǎn)物雜化并延伸，置換已經(jīng)結(jié)合在RCA產(chǎn)物上的下游引物延伸鏈，反復(fù)進(jìn)行延伸和置換，產(chǎn)生樹(shù)狀的RCA擴(kuò)增產(chǎn)物。

以4BaseBio公司的TruePrime滾環(huán)擴(kuò)增試劑盒為例，使用TthPrimPol引物酶和Phi29DNA聚合酶，實(shí)現(xiàn)了無(wú)需添加引物即可進(jìn)行擴(kuò)增。

滾環(huán)核酸擴(kuò)增的優(yōu)勢(shì)與不足
RCA 的優(yōu)勢(shì)：
靈敏度高，特異性好，易操作。
RCA 的不足：
信號(hào)檢測(cè)時(shí)的背景問(wèn)題。在RCA反應(yīng)過(guò)程中未成環(huán)的鎖式探針和未結(jié)合探針的模板DNA或者RNA 可能產(chǎn)生一些背景信號(hào)。
依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)
依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（nucleicacid sequence-based amplification, NASBA）是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，是由1對(duì)帶有T7啟動(dòng)子序列的引物引導(dǎo)的連續(xù)、等溫的核酸擴(kuò)增技術(shù)，可以在2h左右將模板RNA擴(kuò)增約109倍，比常規(guī)PCR法高1000倍，不需特殊的儀器。
該技術(shù)一出現(xiàn)就被用于疾病的快速診斷，目前有不少公司的RNA檢測(cè)試劑盒都用此方法。
盡管RNA的擴(kuò)增也可以使用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，NASBA相比則有自己的優(yōu)勢(shì)：可以在相對(duì)恒溫的條件下進(jìn)行，相對(duì)傳統(tǒng)的PCR技術(shù)更為穩(wěn)定、準(zhǔn)確。
反應(yīng)在41攝氏度下，需要AMV（avian myeloblastosis virus）逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶和一對(duì)引物來(lái)完成。
其過(guò)程主要包括：
正向引物包含T7啟動(dòng)子互補(bǔ)序列，反應(yīng)過(guò)程中正向引物與RNA鏈結(jié)合，由AMV酶催化形成DNA-RNA雙鏈。
RNA酶H消化雜交雙鏈中的RNA,保留DNA單鏈。
在反向引物與AMV酶的作用下形成含有T7啟動(dòng)子序列的DNA雙鏈。
在T7 RNA聚合酶的作用下完成轉(zhuǎn)錄過(guò)程，產(chǎn)生大量目的RNA。

NASBA的優(yōu)勢(shì)：
（1）它的引物上帶有T7啟動(dòng)子序列，而外來(lái)雙鏈DNA無(wú)T7啟動(dòng)子序列，不可能被擴(kuò)增，因此該技術(shù)具有較高的特異性和靈敏度。
（2）NASBA將反轉(zhuǎn)錄過(guò)程直接合并到擴(kuò)增反應(yīng)中，縮短了反應(yīng)時(shí)間。
NASBA的劣勢(shì)：
（1）反應(yīng)成分比較復(fù)雜。
（2）需要3種酶使得反應(yīng)成本較高。
參考文獻(xiàn)：
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3.趙璐瑤等，基于環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增的快檢技術(shù)研究
4.England biolabs, Loop Mediated Isothermal Amplification.
5.G.TerranceWalker etc. Strand displacement amplification isothermal, in vitro DNA amplification technique.
6.吳曉亮等，DNA的滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展。
7.各公司官網(wǎng)。
03
下篇：測(cè)序技術(shù)
本篇作為分子診斷技術(shù)全解析的最后一篇，介紹一下測(cè)序技術(shù)。
基因測(cè)序技術(shù)始于1977年，sanger發(fā)明的DNA雙脫氧末端終止測(cè)序法拉開(kāi)了序幕。Sanger在1958年和1980年因?yàn)橐葝u素測(cè)序和DNA測(cè)序而兩度獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，是第四位兩度獲得諾貝爾獎(jiǎng)以及唯一獲得兩次諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的人。

Sanger測(cè)序
Sanger測(cè)序采用四個(gè)雙脫氧核糖核酸(ddNTP)加入到正在合成的鏈上，由于雙脫氧核糖核酸少了一個(gè)氧原子，一旦被加入到DNA鏈上，反應(yīng)即終止。
通過(guò)構(gòu)建四個(gè)反應(yīng)體系，加入AGCT四種雙脫氧核糖核酸，同時(shí)調(diào)節(jié)脫氧核糖核酸(dNTP)和ddNTP的相對(duì)濃度，可以使反應(yīng)擴(kuò)增得到幾百至上千堿基的終止產(chǎn)物。
隨后通過(guò)凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離，分為四個(gè)泳道，每個(gè)泳道對(duì)應(yīng)一種堿基，然后讀取條帶顯影結(jié)果。

該方法因準(zhǔn)確率高，被稱(chēng)為基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是耗時(shí)長(zhǎng)，成本高。
2001年人類(lèi)基因組計(jì)劃就是采用sanger測(cè)序完成的，從1990年人類(lèi)基因組計(jì)劃建立開(kāi)始，全球的科學(xué)家歷時(shí)11年耗資30億美元完成。
進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著物理及化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，開(kāi)始采用相同激發(fā)波長(zhǎng)但不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光集團(tuán)來(lái)標(biāo)記ddNTP，ATGC對(duì)應(yīng)不同的熒光基團(tuán)產(chǎn)生不同顏色的光被計(jì)算機(jī)讀取，測(cè)序的速度和效率大大提高。
二代測(cè)序
第二代測(cè)序技術(shù)也稱(chēng)高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)，相對(duì)于一代測(cè)序，它可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模平行測(cè)序，基本原理是將基因組分割成短片段，對(duì)短片段測(cè)序再進(jìn)行拼接。
對(duì)比第一代測(cè)序技術(shù)擁有著高通量、低成本等優(yōu)勢(shì)，目前相同數(shù)據(jù)量的檢測(cè)，其成本約為一代測(cè)序技術(shù)的0.01%，極大地推動(dòng)了測(cè)序技術(shù)在臨床檢測(cè)方面的應(yīng)用。
2005年454公司基于焦磷酸測(cè)序法推出了Genome Sequencer 20 System(GS 20)系統(tǒng)，開(kāi)啟了高通量測(cè)序的進(jìn)程。2007年，羅氏公司收購(gòu)了454，并推出了一系列性能更優(yōu)的NGS系統(tǒng)，極大的提升測(cè)序通量和準(zhǔn)確性。
盡管具有讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，但是測(cè)序通量和成本始終限制了454平臺(tái)的推廣，同樣數(shù)據(jù)量下成本約是illumina的100倍，因此羅氏在2016年底終止了454NGS測(cè)序相關(guān)的業(yè)務(wù)。
2006年Solexa公司推出了Genome Analyzer系統(tǒng)，包括DNA簇、橋式PCR和可逆阻斷等技術(shù)，這使得GA系統(tǒng)在高通量、低成本、應(yīng)用范圍廣等方面具有明顯優(yōu)點(diǎn)。2007年，Illumina公司收購(gòu)了Solexa并發(fā)布二代測(cè)序儀。
二代測(cè)序經(jīng)過(guò)這些年的發(fā)展已經(jīng)步入成熟期，目前市場(chǎng)上根據(jù)測(cè)序技術(shù)可以可以把二代測(cè)序平臺(tái)分為4類(lèi)：邊合成邊測(cè)序法（Illumina）、半導(dǎo)體測(cè)序法（ThermoFisher）、聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法(華大智造)和焦磷酸測(cè)序法。
Illumina邊合成邊測(cè)序
Illumina測(cè)序的流程主要包括樣品制備，簇生成，測(cè)序，數(shù)據(jù)分析。
首先是樣本制備和建庫(kù)。用DNA或RNA抽提試劑盒提取核酸，然后用超聲波將其隨即打斷成90-250bp左右的長(zhǎng)度或者控制全部DNA在一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)。
為了后續(xù)的擴(kuò)增和測(cè)序，需要在這些DNA片段加入特定的序列。如下圖，分別是與流動(dòng)池引物互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域（P5、P7）、與Read 1和read 2測(cè)序引物結(jié)合的區(qū)域（Rd1SP，Rd2 SP）以及標(biāo)簽序列區(qū)域Index。

添加完接頭序列的DNA合集稱(chēng)為DNA文庫(kù)，這樣就完成了建庫(kù)，該步驟可以采用商業(yè)化的文庫(kù)制備試劑盒完成。
第二步是成簇Cluster Generation。
成簇是上述DNA片段被擴(kuò)增的過(guò)程，該過(guò)程在流動(dòng)池(Flow cell) 中完成。流動(dòng)池是一種含有8個(gè)通道的厚玻璃片，每條通道中都隨即植入了能與文庫(kù)接頭P5或P7互補(bǔ)結(jié)合的短DNA片段。

首先引物和流動(dòng)池的固定DNA片段互補(bǔ)配對(duì)，固定在通道表面，然后在DNA聚合酶作用下DNA鏈進(jìn)行互補(bǔ)延伸形成DNA雙鏈。通過(guò)變性，其中的單鏈被洗脫，剩下的一條單鏈會(huì)與旁邊的固定接頭鏈接，形成單鏈橋。

同樣的，單鏈橋在DNA聚合酶作用下延伸配對(duì)形成雙鏈橋，通過(guò)變性形成2條單鏈，這兩條單鏈又分別與旁邊的固定引物結(jié)合，形成2個(gè)單鏈橋。重復(fù)這個(gè)循環(huán)，最終形成數(shù)百萬(wàn)的DNA簇。

上述過(guò)程所有的DNA片段都會(huì)被擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，反向連會(huì)被切斷洗脫，只留下正向鏈，為防止互補(bǔ)結(jié)合重新形成單鏈橋，3‘端被封鎖。

第三步，測(cè)序。
首先，在流動(dòng)池中加入熒光標(biāo)記的dNTP和酶，由引物起始開(kāi)始合成子鏈。由于dNTP存在 3’端疊氮基會(huì)阻礙子鏈延伸，因此每個(gè)循環(huán)只能測(cè)得一個(gè)堿基。合成完一個(gè)堿基后，洗掉多余的dNTP和酶，使用激光掃描獲得熒光信號(hào)。
隨后加入試劑將疊氮基團(tuán)與熒光基團(tuán)切除，然后流動(dòng)池再通入熒光標(biāo)記的dNTP和酶，由引物起始開(kāi)始合成一個(gè)堿基。不斷重復(fù)這個(gè)過(guò)程，完成第一次讀取。

所有的DNA片段的一個(gè)堿基會(huì)被同時(shí)讀取，在大規(guī)模并行的過(guò)程中，機(jī)器讀取的圖像類(lèi)似下面這樣：

同時(shí)，加入了不同的index來(lái)區(qū)分每個(gè)樣本及正負(fù)鏈。在完成第一次讀取后，復(fù)制出的鏈會(huì)被洗去，index片段引物被引入并與模板雜交，完成序列讀取后被洗去。這樣讀取到的序列與開(kāi)始時(shí)已知的index比對(duì)后就可以給測(cè)得的序列貼上標(biāo)簽，方便后續(xù)分析。
Paired-end測(cè)序已經(jīng)是現(xiàn)在的主流，要完成雙末端測(cè)序，首先要將模板鏈3’去保護(hù)，模板折疊，index片段引入，在聚合酶參與下形成雙鏈橋，然后變性，恢復(fù)為單鏈，然后將正向鏈切除并洗去，留下反向鏈，與正向鏈類(lèi)似，經(jīng)過(guò)多個(gè)循環(huán)后完成讀取。
第四步，數(shù)據(jù)分析
測(cè)序完成后會(huì)產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)個(gè)reads，基于在樣品準(zhǔn)備時(shí)構(gòu)建的index 分類(lèi)來(lái)自不同樣本的序列。對(duì)于每個(gè)樣品來(lái)說(shuō)，具有相似延伸的堿基被聚在一起。正向和反向read配對(duì)生成連續(xù)序列。這些序列通過(guò)與參考基因組匹配后，實(shí)現(xiàn)完整序列的構(gòu)建。
Thermo Fisher半導(dǎo)體測(cè)序法
賽默飛的Ion Torrent平臺(tái)是基于半導(dǎo)體技術(shù)的高通量測(cè)序儀。該平臺(tái)使用了一種布滿(mǎn)小孔的高密度半導(dǎo)體芯片，一個(gè)小孔就是一個(gè)測(cè)序反應(yīng)池，孔底部帶有感應(yīng)器。

其測(cè)序的核心技術(shù)是利用半導(dǎo)體技術(shù)進(jìn)行信息讀取，測(cè)序過(guò)程中每當(dāng)有堿基結(jié)合，便會(huì)釋放H+，而氫離子會(huì)引起電勢(shì)的改變從而被檢測(cè)到。通過(guò)對(duì)氫離子的檢測(cè)并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，最終實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)堿基判讀。
其測(cè)序的流程主要包括建庫(kù)，油包水PCR，測(cè)序，數(shù)據(jù)分析。
首先是建庫(kù)
與illumina 的 3’端帶突出 T 堿基粘性末端的接頭有所不同，建庫(kù)過(guò)程中DNA兩端加入的是平端接頭（P1）和X或A接頭，X接頭帶有index，A接頭不帶。

X 接頭帶Barcode 序列（近末端藍(lán)色序列），而A 接頭不帶Barcode 序列。
X 接頭的好處是可以把一個(gè)芯片的測(cè)序通量分配給多個(gè)文庫(kù)，測(cè)完序之后用Barcode 區(qū)分。
A 接頭的好處是直接測(cè)到樣本序列，這樣對(duì)于充分利用測(cè)序的讀長(zhǎng)無(wú)疑是更好的。但是它的缺點(diǎn)是沒(méi)有Barcode，所以一張芯片只能放一個(gè)樣本。
AmpliSeq 是Ion Torrent 平臺(tái)上的建庫(kù)方案，它的核心是通過(guò)多重PCR 的方法，一次從樣本中把要測(cè)序的多個(gè)DNA 片段給擴(kuò)增出來(lái)，然后轉(zhuǎn)化成文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

PCR 產(chǎn)物兩端20-30bp 堿基都是 PCR引物的序列，如果將其進(jìn)行測(cè)序，則會(huì)浪費(fèi)掉相當(dāng)一部分測(cè)序讀長(zhǎng)及數(shù)據(jù)量。因此在這個(gè)引物上特別設(shè)計(jì)了一種化學(xué)修飾，這種化學(xué)修飾可以被Fupa試劑所消化，而后的測(cè)序就可以盡可能多地測(cè)到樣本序列。
乳液PCR或油包水PCR
Ion Torrent 測(cè)序前需要把文庫(kù)結(jié)合到測(cè)序微珠上去，并且進(jìn)行擴(kuò)增，此種方法稱(chēng)為油包水PCR，也稱(chēng)Emulsion PCR（乳液PCR）。
EP 管中包含油相和水相，其中水相是核心，油相起到分隔作用。水相中包括文庫(kù)、引物、酶、MasterMix、測(cè)序微珠等PCR反應(yīng)的主要成份。

測(cè)序微珠的直徑約1~2.4微米，每個(gè)油包水PCR都含有許多微珠，這些微珠的表面共價(jià)連接了許多PCR引物，與P1序列互補(bǔ)。
同時(shí)油包水PCR中的游離PCR引物，其序列與A/X接頭一致，且5‘端都標(biāo)記了生物素。
把引物、酶、測(cè)序微珠等先在水相中混合，再加入油，混合形成乳濁液，油把水相分隔成一個(gè)個(gè)的小水滴。PCR反應(yīng)后，微珠表面就會(huì)長(zhǎng)出水滴內(nèi)所含DNA 文庫(kù)的擴(kuò)增拷貝。

然后加入帶有鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠與微珠進(jìn)行混合。發(fā)生了PCR 的微珠由于其引物上帶有生物素，便會(huì)與磁珠結(jié)合；沒(méi)有發(fā)生PCR 的微珠由于沒(méi)有生物素，不會(huì)與磁珠結(jié)合。接著，用磁鐵吸附富集有效微珠，再清洗掉上清液中沒(méi)有PCR 的微珠，最后用洗脫液把微珠與磁珠分離開(kāi)來(lái)，進(jìn)行測(cè)序。
測(cè)序
測(cè)序主要發(fā)生在一張半導(dǎo)體芯片上，上面做了數(shù)以百萬(wàn)、千萬(wàn)計(jì)的小孔，每個(gè)小孔的既是測(cè)序微珠的容器，又同時(shí)是一個(gè)微型的PH 計(jì)。
每個(gè)小孔正好可以容納一個(gè)測(cè)序微珠，當(dāng)DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸的DNA鏈上時(shí)，會(huì)釋放出一個(gè)氫離子，反應(yīng)池中的PH發(fā)生改變，位于池下的離子感受器就會(huì)感受到信號(hào)，把化學(xué)信號(hào)直接轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，從而讀出DNA序列。

數(shù)據(jù)分析
把分別含Ａ、C、G、T 四種 dNTP 的溶液，分別依次地流過(guò)芯片的表面。
舉例來(lái)說(shuō)，流入的是dCTP 溶液，而模板上正好有一個(gè)G 堿基，就發(fā)生聚合反應(yīng)，并產(chǎn)生電壓變化，而且會(huì)被記錄下來(lái)。如果流入的溶液與模板上的堿基不匹配，就不會(huì)發(fā)生聚合反應(yīng)，也就沒(méi)有電壓變化，也就不會(huì)有堿基被記錄下來(lái)。
如果正好有 2 個(gè)一樣的堿基相鄰，一次就會(huì)有2 個(gè)堿基被聚合到DNA 鏈上，電壓變化值就會(huì)加倍，序列中2 個(gè)新的堿基被記錄下來(lái)。
華大智造聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法
2013年3月18日，華大基因?qū)G(Complete Genomics)公司全額收購(gòu)，開(kāi)啟了華大測(cè)序儀之路。歷經(jīng)多年的研發(fā)和改進(jìn)，華大基因相繼推出的BGISEQ-500、BGISEQ-50、MGISEQ-200、MGISEQ-2000M、MGISEQ-T7等測(cè)序體系。
其測(cè)序平臺(tái)采用的是DNB（DNA Nanoball ，DNA納米球）測(cè)序技術(shù)，每個(gè)DNA的直徑約220-240nm。
主要步驟包括文庫(kù)制備，cPAS測(cè)序，數(shù)據(jù)分析等。
樣本準(zhǔn)備和建庫(kù)
MGI文庫(kù)構(gòu)建采用泡狀接頭及與之對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，有長(zhǎng)接頭及短接頭，單端和雙端index。

將文庫(kù)進(jìn)行單鏈分離及環(huán)化處理后，以單鏈環(huán)狀DNA為模板，在DNA聚合酶作用下使用滾環(huán)擴(kuò)增將單鏈環(huán)狀DNA擴(kuò)增2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物被稱(chēng)為DNB。

DNB經(jīng)過(guò)DNB裝載技術(shù)固定在陣列化的硅芯片上形成納米芯片，由于一個(gè)DNB結(jié)合到芯片上的小孔后會(huì)排斥其他DNB結(jié)合，因此每個(gè)小孔僅容納一個(gè)DNB，保證了信號(hào)點(diǎn)間不會(huì)相互干擾。
測(cè)序
采用半導(dǎo)體加工工藝，在經(jīng)過(guò)修飾的硅片表面形成結(jié)合位點(diǎn)陣列（直徑約200nm），實(shí)現(xiàn)DNA納米球的規(guī)則排列吸附，陣列位點(diǎn)的間距約700nm，每個(gè)位點(diǎn)只固定一個(gè)DNB，保證不同納米球之間的光信號(hào)不會(huì)互相干擾。
帶有熒光探針的Read1引物在DNB上匹配互補(bǔ)，隨后系統(tǒng)對(duì)光信號(hào)采集，得到待測(cè)序列。
MDA（multipledisplacement amplification）二鏈測(cè)序，隨機(jī)引物在多個(gè)位點(diǎn)與模板DNA結(jié)合，在Phi29DNA聚合酶作用下起始復(fù)制，沿著DNA模板合成DNA，同時(shí)取代模板互補(bǔ)鏈；被置換的互補(bǔ)鏈又變成新的模板進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增。完成第一鏈測(cè)序后，在該酶作用下形成第二鏈，通過(guò)DNA分子錨，進(jìn)行第二鏈cPAS測(cè)序。

第三代測(cè)序技術(shù)
1.PacBio SMRT單分子測(cè)序技術(shù)
Pacific Biosciences于2004年成立，2010年納斯達(dá)克上市，2011年P(guān)acBioRS發(fā)布。
以PacBio測(cè)序?yàn)榇淼牡谌驕y(cè)序技術(shù)逐漸應(yīng)用到多個(gè)科研領(lǐng)域。該平臺(tái)利于單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)，又稱(chēng)作SMRT（Single Molecule Real-Time）測(cè)序，基于納米小孔的單分子讀取技術(shù)，無(wú)需擴(kuò)增即可快速完成序列讀取。
建庫(kù)
因?yàn)闇y(cè)序讀長(zhǎng)很長(zhǎng)，因此可以制備大片段（3-10kb）文庫(kù)；不同于其他二代測(cè)序文庫(kù)，該文庫(kù)兩端分別連接環(huán)狀單鏈，單鏈兩端又與雙鏈正負(fù)鏈連接，得到類(lèi)似啞鈴的結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為SMRT Bell。

測(cè)序
SMRT Cell芯片含有數(shù)百萬(wàn)個(gè)納米級(jí)的零模波導(dǎo)孔（zero-mode wave guides, ZMWs），ZMW是一個(gè)直徑只有10~50nm的孔，引物在模板的單鏈環(huán)部位退火后，這個(gè)雙鏈部位就可以結(jié)合到已固定在ZWM底部的聚合酶上。
每個(gè)ZMW都能夠包含一個(gè)DNA聚合酶及一條DNA樣品鏈進(jìn)行單分子測(cè)序，4種dNTP帶有不同的熒光標(biāo)記。當(dāng)激光打在ZMW底部時(shí)，只能照亮很小的區(qū)域，DNA聚合酶就被固定在這個(gè)區(qū)域。

只有在這個(gè)區(qū)域內(nèi)，堿基攜帶的熒光基團(tuán)被激活從而被檢測(cè)到。當(dāng)DNA合成進(jìn)行時(shí)，下一個(gè)堿基進(jìn)行延伸，上一個(gè)dNTP上的熒光基團(tuán)就會(huì)被切除，保證了檢測(cè)的連續(xù)性。
不同的堿基會(huì)發(fā)出不同的光，此時(shí)根據(jù)光的波長(zhǎng)及峰值便可判斷堿基類(lèi)型。
2.納米孔測(cè)序技術(shù)
2005年，牛津納米孔科技有限公司(Oxford Nanopore Technologies)成立，致力于納米孔測(cè)序技術(shù)的商業(yè)轉(zhuǎn)化。2014年Nano space單分子測(cè)序技術(shù)發(fā)布。
牛津納米孔公司開(kāi)發(fā)的納米單分子測(cè)序技術(shù)與以往的測(cè)序技術(shù)皆不同，它是基于電信號(hào)而不是光信號(hào)。
納米孔測(cè)序技術(shù)的核心是一種整合了多個(gè)跨膜通道蛋白（即納米孔蛋白）的多聚物膜。通過(guò)在膜兩側(cè)施加電壓從而產(chǎn)生穩(wěn)定的穿過(guò)納米孔的電流。當(dāng)有其他物體穿過(guò)納米孔時(shí)，會(huì)影響電流的大小，從而產(chǎn)生可識(shí)別的電信號(hào)的變化。
測(cè)序時(shí)，DNA雙鏈在馬達(dá)蛋白的牽引下解螺旋為單鏈DNA，并穿過(guò)納米孔蛋白（也叫Reader蛋白）。由于ATCG四種堿基結(jié)構(gòu)和大小的差異，會(huì)使電流產(chǎn)生特征性離子電流變化，通過(guò)識(shí)別這種電信號(hào)的變化，從而達(dá)到讀取堿基序列的目的。

不同型號(hào)的納米孔測(cè)序儀原理非常一致，其核心均為納米孔測(cè)序芯片。常規(guī)的納米孔測(cè)序芯片整合512個(gè)測(cè)序通道，每個(gè)測(cè)序通道包含四個(gè)納米孔，官方數(shù)據(jù)顯示單張芯片不間斷測(cè)序48h，可產(chǎn)生20-30G的數(shù)據(jù)量。

二代測(cè)序的出現(xiàn)極大地解決了通量問(wèn)題，在大幅提高測(cè)序速度和準(zhǔn)確性的同時(shí)大大降低了測(cè)序成本，但閱讀長(zhǎng)度相對(duì)較短。而以單分子測(cè)序?yàn)橹饕卣鞯娜鷾y(cè)序，正朝著單分子、長(zhǎng)讀長(zhǎng)、低成本、小型化的方向發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了測(cè)序領(lǐng)域的又一次變革。
參考文獻(xiàn)：
1.李金明，《高通量測(cè)序技術(shù)》