二代測(cè)序（NGS）是基于PCR和基因芯片技術(shù)，由一代測(cè)序發(fā)展而來的，可以平行測(cè)序的技術(shù)，具有通量高，速度更快的優(yōu)點(diǎn)。在進(jìn)行NGS實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要把樣本DNA提取之后，在進(jìn)行建庫(kù)，然后上機(jī)測(cè)試，最后獲得數(shù)據(jù)后，進(jìn)行生信分析。在測(cè)序整個(gè)流程中，對(duì)于樣本質(zhì)量的要求非常高。低質(zhì)量的DNA以及建庫(kù)產(chǎn)物，會(huì)影響到文庫(kù)轉(zhuǎn)化率，測(cè)序的深度，復(fù)雜性和均一性等指標(biāo)。所以測(cè)序做的好不好，質(zhì)控很重要。

安捷倫質(zhì)控儀器，例如2100生物分析儀，Tapestation系統(tǒng)和片段化分析儀等，均可以對(duì)NGS全流程進(jìn)行質(zhì)控。今天魯大師就帶著大家看看NGS質(zhì)控要點(diǎn)。

測(cè)序樣本質(zhì)控

1.基因組DNA

影響因素：

儲(chǔ)存條件，例如溫度，儲(chǔ)存環(huán)境、提取方法

安捷倫獨(dú)創(chuàng)DIN值，數(shù)字化評(píng)判g(shù)DNA質(zhì)控，使電泳圖的解釋更容易，便于樣品的比較，并為NGS技術(shù)提供了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和高質(zhì)量基因組DNA的定量

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的樣本制備從提取RNA。RNA完整性對(duì)于下游建庫(kù)和測(cè)序尤為重要。

RNA-seq cDNA合成

RNA-seq文庫(kù)制備的一個(gè)重要步驟是將mRNA從總RNA中分離出來，并通過逆轉(zhuǎn)錄將其轉(zhuǎn)化為cDNA(互補(bǔ)DNA)，用于后續(xù)的文庫(kù)制備步驟和測(cè)序。

片段質(zhì)量評(píng)估

目標(biāo)DNA片段的大小是NGS文庫(kù)構(gòu)建的關(guān)鍵因素。對(duì)核酸進(jìn)行片段化的方法主要包括物理打斷和酶打斷。物理方法包括聲波剪切（和超聲，酶切方法包括非特異性內(nèi)切酶和轉(zhuǎn)座酶片段化。根據(jù)需求，DNA片段長(zhǎng)度可在150–800 bp之間。

接頭連接

片段化后的DNA需要加上接頭。 接頭其實(shí)就是一段已知的短核苷酸序列，用于鏈接未知的目標(biāo)測(cè)序片段。接頭添加方式不盡相同，但是接頭連接情況，我們可以通過安捷倫質(zhì)控儀器進(jìn)行檢測(cè)。

文庫(kù)最終產(chǎn)物質(zhì)控

文庫(kù)制備的最后一步是需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而富集接頭連接的片段，產(chǎn)生足夠的文庫(kù)拷貝用于測(cè)序。良好的質(zhì)控確保了高質(zhì)量的文庫(kù)準(zhǔn)備，確定最終文庫(kù)的大小、濃度和摩爾濃度。

兩大影響因素：

● 接頭二聚體

● 拷貝數(shù)大小

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