研究背景

全世界每年的植骨手術(shù)超過200萬例，但都存在供體組織可獲得性和供體部位發(fā)病率問題的限制或成本和疾病傳播的問題。這些問題推動(dòng)研究者們使用新的、具有成本效益的組織工程方法來研究治療骨缺陷。3D打印是一種新興且有前途的技術(shù)，可以為所有這些限制提供解決方案。目前用于骨組織工程的臨床相關(guān)生物材料包括骨塊、骨片和骨黏合劑。3D打印允許通過逐層沉積骨黏合劑來模擬三維骨骼結(jié)構(gòu)。絲素蛋白由于其可調(diào)節(jié)的機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性，生物相容性和骨整合而被廣泛用于組織工程應(yīng)用。羥基磷灰石是骨骼的主要無機(jī)部分，通過將磷酸鈣羥基磷灰石與絲相結(jié)合，可以更好地利用其化學(xué)組成和機(jī)械性能以更接近天然骨組織的性能。此外，已有強(qiáng)有力的證據(jù)表明血管化和神經(jīng)在骨修復(fù)中的重要性，因此，在骨支架內(nèi)建立神經(jīng)血管化網(wǎng)絡(luò)可以促進(jìn)更快、更高質(zhì)量骨組織的再生。

工作介紹

本文開發(fā)了一種絲素/羥基磷灰石骨黏合劑，用于三維打印可定制的骨工程支架。為了驗(yàn)證該骨黏合劑作為骨組織工程生物材料的潛力，對其力學(xué)性能、結(jié)構(gòu)和微孔率進(jìn)行了表征。通過研究支架在體外維持人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞黏附、生長、增殖和分化的能力，進(jìn)一步研究了它們的生物學(xué)相關(guān)性。最后，使用生長因子和促進(jìn)骨誘導(dǎo)(BMP2)、血管化(VEGF)和神經(jīng)支配(NGF)的形態(tài)因子對骨黏合劑進(jìn)行功能化。

圖文導(dǎo)讀

圖1? silk-HAP 材料的表征。(a) 3D 打印的 10 × 10 × 10 mm 立方體的顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描，顯示了立方體的總體外觀（右上）、規(guī)則的絲狀分布和相互連通的孔。比例尺：1 mm。(b) 3D 打印解剖結(jié)構(gòu)：股骨（左）；椎骨（右，上）；下頜骨（右，下）。比例尺：1 cm。(c) 3D 打印結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微 (SEM)，表明能控制細(xì)絲沉積和較大的孔隙（左）；細(xì)絲表面存在微孔（中）；用于silk-HAP骨黏合劑的羥基磷灰石 (HAP) 粉末，表明顆粒分布（右）。(d) 3D 打印圓柱體，表明能控制微孔率和細(xì)絲沉積。比例尺：1 mm。(e) 未燒結(jié)（左）和燒結(jié)（右）10 × 10 × 10 mm 立方體，使用 10% silk濃度 3D 打印，顯示了燒結(jié)對結(jié)構(gòu)外觀和尺寸的影響。比例尺：5 mm。(f) HAP粉末、印刷后的silk/HAP 和干燥后的silk/HAP 的FTIR 光譜。(g)?濃度、PBS浸漬和印刷后工藝（如燒結(jié)）的影響（1100 ℃，3 小時(shí)）。(n = 5)對絲/羥基磷灰石骨黏合劑干燥后的抗壓強(qiáng)度(MPa)和楊氏模量。

圖2? 3D 打印silk/HAP 支架的細(xì)胞相容性。(a) alamarBlue (n = 9) hMSCs在 3D 打印結(jié)構(gòu)/聚苯乙烯上培養(yǎng)，分別在生長或成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)35 天。（b-c）在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng) 35 天后，3D 打印支架上的hMSCs SEM照片（b）共聚焦顯微鏡（c，頂部）和明場顯微鏡（c，底部），顯示細(xì)胞覆蓋率和對支架的粘附，以及細(xì)胞在孔中和細(xì)絲之間的生長。藍(lán)色：細(xì)胞核（DAPI）；白色：肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架(鬼筆環(huán)肽-488)。比例尺：100 μm。（為了解釋這個(gè)圖例中對顏色的引用，讀者可以參考本文的網(wǎng)絡(luò)版本。）

圖3? 3D 打印支架的骨傳導(dǎo)性。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在生長培養(yǎng)基或成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天后，堿性磷酸酶(ALP)活性與蛋白質(zhì)含量(上)歸一化。在生長（左）或成骨（右）培養(yǎng)基（底部，比例尺：5 mm）中培養(yǎng) 21 天后，對hMSCs進(jìn)行堿性磷酸酶染色。。（ b ）成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物骨橋蛋白(OPN，洋紅色)免疫熒光染色，顯示OPN在成骨培養(yǎng)基中表達(dá)增加。作為參考，細(xì)胞核(藍(lán)色，DAPI)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架(白色，Phalloidin-488)顯示在頂部面板中。比例尺：100μm。

圖4? 釋放加載到 Silk-HAP 支架中的因子。打印和浸泡的樣品中BMP-2（a），VEGF（c）和NGF（e）隨時(shí)間的釋放計(jì)算為單因素（BMP-2/VEGF/NGF）和三因素（BVN）。打印和浸泡樣品中BMP-2（b），VEGF（d）和NGF（f）隨時(shí)間的累積釋放計(jì)算為單因子（BMP-2/VEGF/NGF）和三因子（BVN）。數(shù)據(jù) 表示為平均值±SD（n=5）。

圖5? 在沒有額外生長因子（對照）的情況下在絲支架上接種7天的hMSC的Runx2（a），OPN（b）和BSP（c）標(biāo)志物的基因表達(dá)，或加載了形態(tài)發(fā)生因子BMP2在印刷過程之前/后（BMP2打印）。數(shù)據(jù)為平均值±SE（n=3-5）*:p?0.05；**：p?0.01；***：p?0.001(d）?在培養(yǎng)3小時(shí)后覆蓋transwell底部（DAPI染色），顯示HUVEC遷移情況(e）培養(yǎng)3天和7天后3D打印構(gòu)支架上HUVEC的alamarBlue強(qiáng)度（n=6）(f）培養(yǎng)7天后3D打印支架上hiNSCs的alamarBlue強(qiáng)度（n=6）。

圖6? 在絲支架上沒有額外的生長因子（對照）或在 3D 打印過程（浸泡）后加載 NGF接種 3 天，巢蛋白?(a)、微管蛋白?β3 (Tubb3) (b) 和微管相關(guān)蛋白 2 (MAP2) (c) 的 NSC（巢蛋白）和分化神經(jīng)元（Tubb3 和 MAP2）標(biāo)記物的基因表達(dá)，數(shù)據(jù)代表平均值?± SE (n = 3–5) **: p ?0.01; ***：p ?0.001。

圖7? 培養(yǎng)7天的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Runx2(A)、OP(B)、BSP(C)標(biāo)志物在無生長因子(對照組)、BMP2(BMP)、BMP2和VEGF(BMP2+VEGF)、BMP2和NGF(BMP2+NGF)、BMP2、VEGF和NGF(BMP2+VEGF+NGF)負(fù)載下的基因表達(dá)。數(shù)據(jù)代表均值±SE(n=3-5)*：P?0.05；**：P?0.01；*：P?0.001。

結(jié)? 論

本研究使用絲素-羥基磷灰石骨黏合劑和骨誘導(dǎo)、促血管生成和神經(jīng)營養(yǎng)生長因子或形態(tài)因子加速骨形成，生成功能化的3D打印支架用于骨再生。通過人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，以及人誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，評估了3D打印支架的功能。該支架具有與骨相適應(yīng)的力學(xué)性能，具有細(xì)胞相容性、骨傳導(dǎo)性，并保持了細(xì)胞因子和形態(tài)因子的活性。基于成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因(Run相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2、骨橋蛋白、骨唾液蛋白)的上調(diào)，確定了BMP-2、VEGF和NGF在體外成骨分化方面的協(xié)同結(jié)果。將需要進(jìn)一步的研究來評估體內(nèi)這些支架設(shè)計(jì)，預(yù)計(jì)這些結(jié)果將對牙科，口腔和頜面外科的骨再生產(chǎn)生強(qiáng)烈影響。

蘇州北科納米可以提供多種生物納米材料 ,致力于推進(jìn)您的研發(fā)進(jìn)程

（部分資料來源于網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)載的目的在于傳遞更多信息及分享，并不意味著贊同其觀點(diǎn)或證實(shí)其真實(shí)性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺，不為其版權(quán)負(fù)責(zé)。如涉及侵權(quán)，請聯(lián)系我們及時(shí)修改或刪除）