DOI:10.1101/gr.5204306

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摘要

????????比較研究需要了解分類(lèi)單元之間的進(jìn)化關(guān)系。然而，形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)和古生物學(xué)數(shù)據(jù)都不能很好的解決完全變態(tài)昆蟲(chóng)主要類(lèi)群之間的發(fā)育關(guān)系問(wèn)題。這里，我們使用了一種新的基因組方案，拼接和分析了185個(gè)核基因組成的數(shù)據(jù)集，選用完全變態(tài)昆蟲(chóng)中主要類(lèi)群的一些模式生物很好的解決了這一問(wèn)題。相對(duì)于人們廣泛認(rèn)同的假說(shuō)，蜜蜂和蜂（膜翅目）才是甲蟲(chóng)(鞘翅目)、蛾(鱗翅目)和蒼蠅(雙翅目)這些主要完全變態(tài)目的基礎(chǔ)。我們仔細(xì)分析了每一個(gè)潛在干擾因素，驗(yàn)證了我們結(jié)論的準(zhǔn)確性。因此，系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)方法能夠解決長(zhǎng)期存留的昆蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)問(wèn)題。

科學(xué)問(wèn)題

????????完全變態(tài)昆蟲(chóng)四大目的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系如何？影響系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的因素有哪些？如何檢驗(yàn)其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是否正確？

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已有假說(shuō)

????????昆蟲(chóng)在個(gè)體發(fā)育中，完整經(jīng)過(guò)卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)等4個(gè)時(shí)期的叫完全變態(tài)昆蟲(chóng)。昆蟲(chóng)綱中最大的幾個(gè)目都屬于完全變態(tài)昆蟲(chóng)（鞘、鱗、膜、雙），而像半翅目、直翅目等就屬于不完全變態(tài)昆蟲(chóng)。在2006年之前，完全變態(tài)昆蟲(chóng)中的主要四大目已經(jīng)被證實(shí)具有同一祖先，但它們之間的系統(tǒng)發(fā)育地位并不是很清楚，普遍認(rèn)為脈翅亞群中的鞘翅目應(yīng)該早于其余三目（長(zhǎng)翅亞群）的分化。

學(xué)術(shù)思路

????????作者選定四大目中的一些模式種（易獲得其基因組等相關(guān)數(shù)據(jù)）和已經(jīng)被證實(shí)為構(gòu)建完全變態(tài)昆蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的最好外群，獲取其表達(dá)序列(EST)信息。通過(guò)不同的建樹(shù)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并分析各種可能導(dǎo)致誤差的原因。因此，從不同方面對(duì)其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證，從而得到最終的結(jié)果。流程：

引言

????????完全變態(tài)昆蟲(chóng)的主要四大目（膜翅目、鞘翅目、鱗翅目、雙翅目）在所有已知?jiǎng)游锏恼急戎谐^(guò)了45%。基于形態(tài)學(xué)、單個(gè)分子標(biāo)記或線粒體DNA序列都證明了這些目的單源性，但從這些方面都不能很好的證明這些目之間的聯(lián)系。

????????雙翅目（蠅）和鱗翅目（蛾）之間的緊密聯(lián)系在長(zhǎng)翅亞群中得到了證實(shí)。然而，鞘翅目（甲蟲(chóng)）和膜翅目（蜜蜂和蜂）之間的系統(tǒng)關(guān)系確仍然不明確。人們廣泛接受的系統(tǒng)發(fā)育假說(shuō)為長(zhǎng)翅亞群和膜翅目是姐妹群的關(guān)系，因此，作為脈翅亞群姐妹群的鞘翅目在四個(gè)目的系統(tǒng)發(fā)育中應(yīng)該處于更基礎(chǔ)的位置。

????????為了解決完全變態(tài)昆蟲(chóng)主要目之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，我們采取了系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)的方法，使用大量核基因去優(yōu)化系統(tǒng)發(fā)育建樹(shù)結(jié)果。基于同時(shí)分析大量核基因的此方法已經(jīng)被證明是深入理解后生動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的一條有希望的途徑。這里，我們證明該方法同樣能夠解決昆蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上一些長(zhǎng)期存留的問(wèn)題。

????????使用表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）序列作為系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)是被證實(shí)為可行的，在昆蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究中使用表達(dá)序列標(biāo)簽序列可追溯到2002年，但利用有效的數(shù)據(jù)去解決問(wèn)題只到近年來(lái)才變得可行。

????????我們的實(shí)驗(yàn)基于6個(gè)模式物種（完全變態(tài)昆蟲(chóng)），是因?yàn)樗鼈兊臏y(cè)序工作已經(jīng)完成或正在進(jìn)行。包括兩個(gè)雙翅目昆蟲(chóng)（黑腹果蠅、岡比亞桉蚊），一個(gè)鱗翅目昆蟲(chóng)（家蠶），一個(gè)鞘翅目昆蟲(chóng)（赤擬谷盜）、兩個(gè)膜翅目昆蟲(chóng)（意大利蜂、麗蠅蛹集金小蜂和吉氏金小蜂）。此外，我們選用了兩個(gè)研究完全變態(tài)昆蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育時(shí)公認(rèn)的外群，直翅目的東亞飛蝗和半翅目的豌豆長(zhǎng)管蚜。

方法

????????作者從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ensembl.org)下載黑腹果蠅、岡比亞桉蚊、西方蜜蜂的多肽序列，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(ftp.ncbi.nlm.nih.gov)下載家蠶、赤擬谷盜、東亞飛蝗、豌豆長(zhǎng)管蚜的mRNA序列，兩種金小蜂則是作者提取了其表達(dá)標(biāo)簽序列。所有的核酸序列數(shù)據(jù)集都用SeqClean (available from www.tigr.org/ tdb/tgi/software/) 除去線粒體DNA、細(xì)菌DNA等潛在污染，然后使用cap3（默認(rèn)設(shè)置）進(jìn)行非冗余拼接。所有的核酸數(shù)據(jù)集都與黑腹果蠅的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行BLASTx。最佳命中的閱讀框被認(rèn)為是正確的閱讀框。然后選擇最長(zhǎng)的不被終止密碼子打斷的肽段作為每個(gè)核苷酸序列對(duì)應(yīng)的肽段。

????????我們對(duì)所有蛋白質(zhì)組對(duì)進(jìn)行了BLASTp搜索。根據(jù)最佳BLAST比對(duì)選擇同源序列，E值設(shè)置為小于10-25。如果每個(gè)序列在各自的蛋白質(zhì)組中都有最佳BLASTp比對(duì)結(jié)果，一組序列在每個(gè)物種中都有一個(gè)成員是被接受的，作為候選同源基因家族。這種所有對(duì)所有最佳命中的要求是非常嚴(yán)格的，因此在推斷的同源性上有很高的可信度。多重序列比對(duì)使用MUSCLE（默認(rèn)設(shè)置）。對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢查，以確保其完整性和一致性。保守度較差的家族或可能包含旁系同源的簇被丟棄。對(duì)于金小蜂科，當(dāng)兩個(gè)物種都有同源序列時(shí)，選擇較長(zhǎng)的序列。在Gblocks（高精度設(shè)置）上去除比對(duì)結(jié)果中的空格和可信度較低的比對(duì)區(qū)域，所有序列兩側(cè)部分應(yīng)該為保守區(qū)域，這部分區(qū)域中的氨基酸不能小于20個(gè)。我們將最終的185個(gè)核序列（大多數(shù)為管家基因），8個(gè)物種的33?809個(gè)氨基酸位置串聯(lián)起來(lái)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

????????首先在phyML上對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了最大似然法建樹(shù)，采用了氨基酸替代經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，即所有位點(diǎn)的替代速率符合伽瑪分布，隨后采用氨基酸進(jìn)化替代模型得到了同樣的結(jié)果。此外，我們用MrBayes評(píng)估了這個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的可信度，采用了與上述相同的序列進(jìn)化模型。我們進(jìn)行了四次獨(dú)立的搜索，每次都從一棵隨機(jī)的樹(shù)開(kāi)始，每十棵樹(shù)抽樣一次，超過(guò)10萬(wàn)代。在每次運(yùn)行不到1000代就達(dá)到平衡時(shí)，前100棵樹(shù)被認(rèn)為是老化的。每次獨(dú)立運(yùn)行最后得到的結(jié)果都是一致的。最后，我們還使用PHYLIP包中的PROTPARS，在最大簡(jiǎn)約準(zhǔn)則下分析了1000個(gè)bootstrap重復(fù)的可信度。

????????為了檢驗(yàn)得到的樹(shù)是否由一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因主導(dǎo)，我們對(duì)完整基因重采樣獲得的1000個(gè)bootstrap數(shù)據(jù)集進(jìn)行了最大似然分析。對(duì)于每一次重復(fù)，我們從上述完整的數(shù)據(jù)集中提取了185個(gè)基因比對(duì)。由于基因在被選擇后沒(méi)有從數(shù)據(jù)集中移除，每個(gè)bootstrap數(shù)據(jù)集不止一次包含一些基因比對(duì)，而其他的則完全缺失;這類(lèi)似于廣泛使用的基于單個(gè)氨基酸位點(diǎn)的自助策略。對(duì)于每個(gè)重復(fù)都采用上述的phyML分析。

????????為了確定鞘翅目和膜翅目的相對(duì)位置是否由這兩個(gè)目之間的比率差異引起，我們?cè)诮鹦》浜统鄶M谷盜間進(jìn)行了相對(duì)比率試驗(yàn)。我們將這一分析和隨后的樹(shù)重建限制在與東亞飛蝗和豌豆長(zhǎng)管蚜相同的位點(diǎn)，從而可靠地推斷出它們的祖先位點(diǎn)。為了更加保守，我們移除了所有在卡方檢驗(yàn)下，X2>1.64,P<0.2的基因。除了意大利蜜蜂外，我們將剩下的114個(gè)基因拼接成16,495個(gè)氨基酸序列。分析采用如上的最大似然法。

????????我們還如上所述，使用最大似然法分析了每個(gè)個(gè)體的蛋白質(zhì)比對(duì)。為了分析figure1中每個(gè)蛋白質(zhì)對(duì)樹(shù)的支持情況，與之前假設(shè)的樹(shù)(膜翅目昆蟲(chóng)和赤擬谷盜交換了位置)進(jìn)行比較，我們比較了每種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)下計(jì)算的可能性;在PAML包中使用Kishino?和 Hasegawa?(1989)的方法估計(jì)了統(tǒng)計(jì)學(xué)支撐。

????????物種與物種之間的組成不均一性采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估：

fmi表示物種m中i型氨基酸串聯(lián)的總數(shù)。Table 3中的值是基于密碼子GC含量偏多的氨基酸(FYMINK/GARP，Table 2，自由度為9)。當(dāng)使用所有氨基酸時(shí)，可以得到性質(zhì)非常相似的結(jié)果（不展示數(shù)據(jù)）。

????????作者的所有系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)分析和測(cè)試都是在Perl腳本中實(shí)現(xiàn)的，這些腳本可在補(bǔ)充材料中獲得。

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結(jié)果與討論?

????????多種建樹(shù)和檢驗(yàn)結(jié)果近乎100%（Table 1）的支持Figure 1中樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。先前普遍認(rèn)為的雙翅目與鱗翅目的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系在樹(shù)中得到了體現(xiàn)。然而，在完全變態(tài)昆蟲(chóng)四大目的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中，膜翅目處于一個(gè)更基礎(chǔ)的位置，而不是鞘翅目。

????????在系統(tǒng)發(fā)育建樹(shù)構(gòu)建的過(guò)程中，堿基組成偏好性與長(zhǎng)支吸引可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果錯(cuò)誤。我們實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)物種，豌豆長(zhǎng)管蚜和意大利蜜蜂，基因組中AT堿基含量偏高，可能導(dǎo)致密碼子中含AT堿基的氨基酸偏多（Table 2），對(duì)此進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（卡方檢驗(yàn)、Table 3）。移除豌豆長(zhǎng)管蚜和意大利蜜蜂后，所得系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與上述一致。

????????因?yàn)閮?nèi)群中的雙翅目與鱗翅目之間最可能發(fā)生長(zhǎng)支吸引，但系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)所反映的兩者之間的關(guān)系與大家公認(rèn)的結(jié)果一致（已通過(guò)形態(tài)學(xué)和化石證據(jù)證明），因此長(zhǎng)支吸引是不太影響上述樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。然而，即使膜翅目昆蟲(chóng)和赤擬谷盜的分支很短，仍然可以想象在這些物種中具有特定替代率的基因可能會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)發(fā)育的偏差。在相對(duì)比率測(cè)試的基礎(chǔ)上排除這些基因，并沒(méi)有改變樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(Table 1)。

????????不當(dāng)?shù)耐馊哼x擇可能會(huì)潛在地影響內(nèi)群系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。雖然我們的兩個(gè)外群物種在進(jìn)化速率和氨基酸組成上有很大的差異，但當(dāng)分別使用東亞飛蝗和豌豆長(zhǎng)管蚜作為外群時(shí)，建樹(shù)結(jié)果保持不變(Table 1)。

???????傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征所支持的長(zhǎng)翅亞群（膜翅目）、脈翅亞群（鞘翅目）之間的關(guān)系與我們所得的結(jié)果不一致，之前的認(rèn)識(shí)是在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上將兩個(gè)亞群完全割裂開(kāi)的，這是不正確的。在以前的分子系統(tǒng)發(fā)育研究中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這一問(wèn)題，是因?yàn)橹暗南到y(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究并沒(méi)有使用基因組這樣大的數(shù)據(jù)集?；趩位蛑亟ㄏ档慕y(tǒng)發(fā)育樹(shù)與上述樹(shù)具有相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，但沒(méi)有較高的bootstrap值支持(Table 1)。因此，大量序列的聯(lián)合分析對(duì)于解決完全變態(tài)昆蟲(chóng)目之間的深層進(jìn)化關(guān)系是必要的。?

結(jié)論

????????通過(guò)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征和只使用幾個(gè)分子序列來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)是存在局限性的，本文就是一個(gè)很好的列子，長(zhǎng)翅亞群與脈翅亞群昆蟲(chóng)在系統(tǒng)發(fā)育上并不是完全割裂開(kāi)的。同時(shí)，系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)方法在對(duì)于解決完全變態(tài)昆蟲(chóng)目之間的系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題上很好的前景。

本研究的不足

????????受限于當(dāng)時(shí)（2006）的測(cè)序技術(shù)和計(jì)算機(jī)功能，所選用的實(shí)驗(yàn)對(duì)象數(shù)量比較少，同時(shí)也局限于模式物種中。