嵌合抗原受體 T 細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫療法是指通過對人體T細(xì)胞進(jìn)行工程化改造，使 T 細(xì)胞可以特異性靶向清除腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到精準(zhǔn)治療癌癥的目的。

2021年6月22日，中國首個(gè)CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品阿基侖賽注射液（奕凱達(dá)）獲批上市，無論是作為中國首個(gè)上市的細(xì)胞藥，還是120萬的價(jià)格，均成為大眾熱議的焦點(diǎn)。

那么到現(xiàn)在一年多時(shí)間，究竟有多少國人接受到了CAR-T的治療呢？依據(jù)復(fù)星凱特的公告：“在正式上市后的一年來，奕凱達(dá)適用于治療既往接受二線或以上系統(tǒng)性治療后復(fù)發(fā)/難治性大B細(xì)胞淋巴瘤，已經(jīng)治療了超過200位中國患者”。?

而去年上市的另外一款CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品倍諾達(dá)（瑞基奧侖賽注射液），來自藥明巨諾，銷售價(jià)格為129萬元，藥明巨諾披露“截至2022年6月10日，藥明巨諾的細(xì)胞免疫治療藥物已成功完成234位中國患者的回輸治療?！?/span>

從這個(gè)臨床治療案例數(shù)量來看，可見CAR-T治療在中國的推廣任重道遠(yuǎn)。雖然一個(gè)重要原因是價(jià)格高昂非一般家庭能夠承受，但是我們認(rèn)為根本原因還在于CAR-T免疫療法尚不完善，在臨床治療上仍存在許多問題，如對腫瘤識別特異性不強(qiáng)、安全性不高、CAR-T在體內(nèi)的持久性較差等。

因此接下來我們就全面的解析下CAR-T細(xì)胞治療在當(dāng)下的挑戰(zhàn)和優(yōu)化策略。

CAR-T發(fā)展史

首先我們回顧一下CAR-T技術(shù)的發(fā)展過程。

1986年Steven Rosenberg報(bào)告了一項(xiàng)關(guān)于腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）的研究，這才讓人們意識到“患者自身的免疫細(xì)胞可以對抗自身癌癥”！

1992年，ZeligEshhar團(tuán)隊(duì)利用抗體結(jié)合域和T細(xì)胞受體上免疫球蛋白的γ或ζ亞單位，通過嵌合單鏈設(shè)計(jì)了細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的特異性激活，從而開發(fā)出第一代CAR-T細(xì)胞。

1997年，Sadelain的團(tuán)隊(duì)證明，將CD28等共刺激信號整合到CAR-T中可增強(qiáng)生存、增殖并保持活性，從而開發(fā)出第二代CAR。隨后，攜帶靶向CD19的CAR-T細(xì)胞被開發(fā)出來，并啟動(dòng)了慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）和急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）的I期臨床試驗(yàn)。

2012年，患上急性淋巴細(xì)胞白血病的Emily參與了費(fèi)城醫(yī)院啟動(dòng)的一項(xiàng)針對兒童B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的CAR-T臨床試驗(yàn)，3周后，Emily的癌細(xì)胞完全消失，10年沒有復(fù)發(fā)。

因此美國開始加速CAR-T細(xì)胞藥的上市，2017年，美國FDA批準(zhǔn)了首款CAR-T細(xì)胞療法上市。到目前為止，FDA批準(zhǔn)了六種用于癌癥治療的CAR-T細(xì)胞治療藥物。

美國上市CAR-T藥品

CAR-T能治療哪些腫瘤

目前CAR-T的主要領(lǐng)域還主要集中在血液腫瘤，主要用于治療兒童和青年復(fù)發(fā)/難治性急性B細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）和成人特定類型的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（B cell non-Hodgkin lymphoma，B-NHL）。

包括復(fù)發(fā)/難治性彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）、復(fù)發(fā)/難治性套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）和復(fù)發(fā)/難治性濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，F(xiàn)L）等。

隨著大量有關(guān)CAR-T臨床研究的開展，針對不同靶點(diǎn)的有關(guān)CAR-T細(xì)胞還有望應(yīng)用于B-NHL、多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）、慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）、急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）、T細(xì)胞淋巴瘤及實(shí)體瘤等領(lǐng)域。

各種血液惡性腫瘤的可能治療靶點(diǎn)

CAR-T的四代技術(shù)

CAR-T 免疫療法中 CAR 的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵，CAR 是融合了可以特異性識別抗原的單克隆抗體的單鏈可變片段（single-chain variablefragments，scFvs），包含可變重鏈區(qū)（variable heavy，VH）和可變輕鏈區(qū)（variable light，VL）與 T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域，且表達(dá)CAR的T細(xì)胞不受 MHC 限制。

目前 CAR 已經(jīng)發(fā)展到第四代。第一代 CAR 的 scFv 只整合了 CD3ζ信號域，可以引發(fā)腫瘤特異性細(xì)胞毒性。部分第一代 CAR-T 細(xì)胞顯示出長期持久性，但是擴(kuò)增有限且不能誘導(dǎo)有意義的抗腫瘤作用。

第二代、第三代 CAR 在 CD3ζ 上游整合了 1 個(gè)或 2 個(gè)共刺激性結(jié)構(gòu)域（通常是 CD28 或 4-1BB），賦予了 T 細(xì)胞更有效的抗腫瘤細(xì)胞作用，同時(shí)增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并改善了 CAR-T 細(xì)胞的增殖和持久性。

第四代CAR被稱為“裝甲CAR”。裝甲 ，即賦予CAR-T一個(gè)裝備，使其更強(qiáng)大。在第二代、第三代CAR 基礎(chǔ)上又整合了其他刺激性結(jié)構(gòu)域，共表達(dá)一些關(guān)鍵的細(xì)胞因子或共刺激配體，旨在修飾腫瘤微環(huán)境，如炎性細(xì)胞因子 IL-12、IL-1或 CD40L分泌，以增強(qiáng)抗原交叉呈遞并促進(jìn)表位擴(kuò)散。

四代CAR-T的不同結(jié)構(gòu)

縱觀這四代 CAR，第一代抗腫瘤作用弱，第三、四代雖然T細(xì)胞對腫瘤殺傷能力增強(qiáng)但給機(jī)體帶來的毒副作用也隨之增加，相較第三、四代而言，第二代 CAR相對溫和，在腫瘤治療中應(yīng)用更廣泛。因此目前全球臨床中主要以CD28或4-1BB共刺激域構(gòu)成的第二代CAR-T為主。CD28或4-1BB共刺激域?qū)Υ龠M(jìn)CAR-T細(xì)胞體內(nèi)增殖和存活具有重要意義，能顯著提高接受CAR-T療法患者的完全緩解率。

CAR-T 細(xì)胞療法面臨的挑戰(zhàn)

當(dāng)前 CAR-T 免疫療法尚未被廣泛應(yīng)用是因?yàn)槊媾R三重挑戰(zhàn)。

挑戰(zhàn)一：克服 CAR-T 脫靶問題，提升特異識別能力。

CAR-T 細(xì)胞只有對腫瘤表面抗原進(jìn)行特異性識別，才能確保其僅攻擊腫瘤細(xì)胞而不對正常組織造成損傷。

然而，多項(xiàng)研究表明腫瘤會通過下調(diào)或丟失表面抗原來逃逸免疫系統(tǒng)識別，如用靶向CD19 的 CAR-T 去治療 B 細(xì)胞淋巴瘤后，高達(dá) 60%的復(fù)發(fā)以CD19抗原丟失為特征。

在實(shí)體瘤中，因異質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境使得 CAR-T一方面很難找到特異性強(qiáng)、安全性高且不易脫靶的治療靶點(diǎn)，另一方面腫瘤會被腫瘤微環(huán)境保護(hù)而免受 CAR-T 細(xì)胞攻擊，這些均導(dǎo)致 CAR-T 在實(shí)體瘤中的應(yīng)用更為艱難。

挑戰(zhàn)二：確保 CAR-T應(yīng)用的安全性

CAR-T毒性主要有兩類：細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性（NTX）或CAR-T細(xì)胞相關(guān)腦病綜合征（CRES）。

CRS“細(xì)胞因子風(fēng)暴”是一種全身炎癥反應(yīng)，由大量活化淋巴細(xì)胞以及髓系細(xì)胞引起廣泛的臨床癥狀，包括發(fā)熱、疲勞、頭痛、皮疹、關(guān)節(jié)痛和肌痛。

CRS是第一次輸注CAR-T細(xì)胞后幾天內(nèi)發(fā)生的最常見的不良反應(yīng)。嚴(yán)重CRS病例以心動(dòng)過速、低血壓、肺水腫、心功能不全、高熱、缺氧、腎損害、肝衰竭、凝血障礙和不可逆器官損害為特征。

細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）發(fā)生機(jī)制

NTX是CAR-T細(xì)胞免疫治療的另一常見并發(fā)癥，發(fā)生在40%以上的患者中。通常出現(xiàn)在CAR-T細(xì)胞輸注后的1至3周內(nèi)，患者表現(xiàn)出各種癥狀，如困惑、遲鈍、震顫、譫妄、找詞困難和頭痛。

挑戰(zhàn)三 ：維持CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持久力。

盡管CAR-T細(xì)胞治療完全緩解率高，然而大部分獲得緩解的患者在幾年內(nèi)表現(xiàn)出疾病復(fù)發(fā)，B-ALL的復(fù)發(fā)率從21%到45%不等。

疾病復(fù)發(fā)的原因是CAR-T細(xì)胞耗竭，CAR-T細(xì)胞耗竭是一種功能障礙狀態(tài)，其特征是由于持續(xù)的抗原刺激，CAR結(jié)構(gòu)的共刺激域和抑制性受體的表達(dá)增加而導(dǎo)致抗原特異性T細(xì)胞的缺失。

最新研究發(fā)現(xiàn)，c-Jun的功能缺陷是T細(xì)胞耗竭的關(guān)鍵所在，c-Jun是調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白質(zhì)水平的主要基因，其缺陷會導(dǎo)致抑制T細(xì)胞活性的蛋白質(zhì)增加。

CAR-T 技術(shù)的優(yōu)化與改良

增強(qiáng) CAR 靶向特異性?

針對陰性抗原癌細(xì)胞的逃逸，可以對scFv進(jìn)行優(yōu)化，通常將其設(shè)計(jì)為靶向兩種抗原甚至三種以上抗原，其結(jié)合任一抗原都會觸發(fā)CAR-T的激活。

使用雙特異性 CD20/CD19 CAR-T可治療復(fù)發(fā) B 細(xì)胞惡性腫瘤患者，Ⅰ期臨床結(jié)果顯示在治療 28 天后總緩解率達(dá)到 82%。

另外已經(jīng)證明，三特異性CD19-CD20-CD22靶向CAR-T細(xì)胞可以在臨床前研究快速消除B細(xì)胞淋巴瘤，基于BAFF配體的CAR-T細(xì)胞同時(shí)靶向三種受體，包括BAFF-R、BCMA和TACI。

布爾邏輯和邏輯門常被用來檢測 CAR 與多種抗原組合的反應(yīng)，以尋找到可提高 CAR-T細(xì)胞的安全性和抗腫瘤效果的方法。

組合抗原識別：“和”、“和 - 非”、“或”

在實(shí)體瘤領(lǐng)域，科學(xué)家們也在努力尋找更多特異性靶點(diǎn)，Pule等將GD2作為靶抗原，利用第二代CAR修飾EBV特異性T細(xì)胞治療兒童神經(jīng)細(xì)胞瘤。

接受治療的11例患者中，6例腫瘤減退或腫瘤細(xì)胞壞死。Ahmed等利用HER-2特異性的二代CAR-T治療HER-2（+）復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移肉瘤。接受治療的19例患者中，4例病情穩(wěn)定，存活時(shí)長12 周至14個(gè)月。

另外，具有代表性的抗原靶點(diǎn)還包括mesothelin，用于治療間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌；CEA，用于治療肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌；MUC-1，用于治療肝癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、胃癌；GPC3，用于治療肝癌；EGFRvII，用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭頸部腫瘤；PSMA，用于前列腺癌等。

增強(qiáng) CAR-T 療法安全性?

CAR-T治療相關(guān)毒性的預(yù)防策略，一方面可以通過CRS和神經(jīng)毒性的預(yù)測性生物標(biāo)志物來進(jìn)行檢測，通過密集的監(jiān)測及時(shí)做出反應(yīng)；另一方面是設(shè)計(jì)更加安全的CAR-T細(xì)胞療法，而目前已經(jīng)達(dá)成共識的策略是給CAR-T裝上“安全開關(guān)”，在人為可控下進(jìn)行治療，且在不良反應(yīng)發(fā)生前及時(shí)踩剎車。

目前臨床上主要是通過降低CAR-T劑量、使用類固醇療法或阻斷IL-6R的抗體來治療CRS。?

由于IL-6與嚴(yán)重的CRS有關(guān)，IL-6通路阻斷為CRS的治療提供了一個(gè)良好的選擇。Tocilizumab是一種IL-6受體拮抗劑，已被批準(zhǔn)由美國FDA批準(zhǔn)。

在CAR T細(xì)胞患者中治療CRS的FDA。另一個(gè)正在探索的CRS管理策略是阻斷IL-1，這是CRS的另一個(gè)重要細(xì)胞因子的罪魁禍?zhǔn)?。IL-1由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與巨噬細(xì)胞的激活途徑。

在CRS的動(dòng)物模型中，通過Anakinra阻斷IL-1受體，導(dǎo)致CRS相關(guān)的死亡率下降。

CRS臨床解決方案

鑒于CAR-T細(xì)胞的過度擴(kuò)增可能導(dǎo)致危及生命的CRS，因此有必要通過增加安全開關(guān)來調(diào)節(jié)CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增和持久性，以減輕意外或嚴(yán)重的毒性。

眾所周知的誘導(dǎo)型胱天蛋白酶9 (iCasp9)自殺基因和小分子控制系統(tǒng)已納入研究，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的小分子藥物充當(dāng)特異性調(diào)節(jié)抗原識別或消耗CAR-T細(xì)胞的關(guān)鍵開關(guān)。

如來那度胺、甲氨蝶呤、阿侖單抗、利妥昔單抗和西妥昔單抗以及正交IL-2，上述單克隆抗體通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)介導(dǎo)CAR-T細(xì)胞的耗竭。

增強(qiáng) CAR-T 細(xì)胞的持久性?

CAR-T細(xì)胞的短期持久性限制了它們的抗腫瘤功效，并可能導(dǎo)致抗原陽性復(fù)發(fā)。

提高CAR-T細(xì)胞持久性的策略有多種，如優(yōu)化CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)、利用記憶性T細(xì)胞、合理設(shè)計(jì)CD4/CD8 CAR-T細(xì)胞的比例。

迄今為止，CD28和4-1BB是CAR-T細(xì)胞產(chǎn)物中最常見的共刺激分子。已經(jīng)證明，與CD28共刺激相比，4-1BB共刺激可以改善CAR-T細(xì)胞衰竭。

值得注意的是，聯(lián)合CD28和4-1BB可以同時(shí)增強(qiáng)抗腫瘤效果并增加CAR-T細(xì)胞的持久性。

此外，個(gè)性化的CAR設(shè)計(jì)有助于提升持久性，如CD4+CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出優(yōu)異的持久性，CD4/CD8 CAR-T細(xì)胞的比例可能會影響治療效果，目前1∶1比例的CD4/CD8 CAR-T細(xì)胞已被證明具有優(yōu)異的抗腫瘤效果。

結(jié)語

免疫細(xì)胞療法，特別是CAR- T細(xì)胞療法，正被越來越多地使用并納入治療癌癥的標(biāo)準(zhǔn)做法中。雖然CAR-T細(xì)胞治療還有這上述三大難題有待解決：特異性、安全性及持久性，但是我們相信我們已經(jīng)走在攻克癌癥正確的道路上了。

參考文獻(xiàn)：

Zhang X, Zhu L, Zhang H, Chen S, Xiao Y. CAR-T Cell Therapy in Hematological Malignancies: Current Opportunities and Challenges.?Front Immunol. 2022;13:927153. Published 2022 Jun 10. doi:10.3389/fimmu.2022.927153

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