基于基因工程技術(shù)將編碼蛋白的DNA序列插入合適的載體后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，用于表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法稱為蛋白質(zhì)重組表達(dá)技術(shù)。按照宿主細(xì)胞來(lái)劃分，蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)可以分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)兩大類，根據(jù)目的蛋白質(zhì)的性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。

一、原核表達(dá)系統(tǒng)存在一定局限性：

原核表達(dá)系統(tǒng)雖然是常見(jiàn)的表達(dá)系統(tǒng)，但不具有蛋白質(zhì)的翻譯后修飾及加工，存在局限性:

1.目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難

2.原核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工修飾體系不完善,不能進(jìn)行糖基化、甲基化修飾，影響某些表達(dá)產(chǎn)物的生物活性。

3.細(xì)菌內(nèi)毒素的影響

4.對(duì)于表達(dá)的真核蛋白來(lái)說(shuō)，不僅易被細(xì)菌蛋白酶降解，而且難實(shí)現(xiàn)真正的分泌出胞，其產(chǎn)量很低。

二、真核表達(dá)系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)勢(shì)和必要性：

1、具有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)

2、具有翻譯后修飾系統(tǒng)

3、可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表達(dá)

真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后的加工修飾體系，表達(dá)的外源蛋白更接近于天然蛋白質(zhì)。利用真核表達(dá)系統(tǒng)可以誘導(dǎo)高效表達(dá)，加快人們對(duì)基因研究以及藥物研究的進(jìn)程?；蚬こ讨谐Ｓ玫恼婧吮磉_(dá)系統(tǒng)有:酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，我會(huì)分別介紹這三個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，先來(lái)講講酵母表達(dá)系統(tǒng)：

酵母是蛋白表達(dá)宿主細(xì)胞的良好選擇。酵母細(xì)胞發(fā)酵簡(jiǎn)單、快速、便宜，易于遺傳操作，具有蛋白質(zhì)翻譯后修飾功能，可分泌表達(dá)，純化工藝簡(jiǎn)單且安全。釀酒酵母是異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)最早開(kāi)始使用的酵母宿主。最近，其它酵母如畢赤酵母，乳酸克魯維酵母，和解脂耶氏酵母已成為有利的宿主細(xì)胞。對(duì)于酵母表達(dá)系統(tǒng)，主要介紹酵母受體細(xì)胞以及酵母載體：

一、酵母受體細(xì)胞（四種）：

1.釀酒酵母：胰島素和胰高血糖素是使用釀酒酵母作為宿主而工業(yè)生產(chǎn)出來(lái)的。

特點(diǎn)：較早使用，了解較為清楚；安全性高，被FDA確認(rèn)為安全生物，但蛋白質(zhì)表達(dá)量較低，易產(chǎn)生過(guò)量糖基化，轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定，易發(fā)生質(zhì)粒丟失

2.畢赤酵母：巴斯德畢赤酵母作為第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)，其優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在遺傳操作更加簡(jiǎn)易，蛋白表達(dá)水平更高，對(duì)蛋白修飾能力更強(qiáng)，例如O-糖基化、N-糖基化和二硫鍵形成，人血清白蛋白，乙型肝炎疫苗，干擾素，胰蛋白酶等以畢赤酵母作為宿主生產(chǎn)。畢赤酵母作為專性需氧酵母，可以使用甲醇作為碳源；是可誘導(dǎo)的AOX1啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)；具有較高的重組滴度，在呼吸條件下不會(huì)通過(guò)產(chǎn)生乙醇而損失碳源，導(dǎo)致更高的生物量形成，產(chǎn)生更多的重組蛋白

3、乳酸克魯維酵母：在工業(yè)上，乳酸克魯維酵母以分泌β-半乳糖苷酶而著稱，以乳酸克魯維酵母為宿主產(chǎn)生的第一個(gè)重組蛋白是牛凝乳酶。乳酸克魯維酵母相對(duì)于釀酒酵母作為宿主的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是它通過(guò)糖酵解和戊糖磷酸途徑代謝己糖。

4、解脂耶氏酵母：解脂耶氏酵母以碳?xì)浠衔铮ɡ缡灪陀停┳鳛樘荚吹哪芰Χ劽?。?jù)報(bào)道它分泌高水平的天然和異源蛋白質(zhì)。例如，解脂耶氏酵母的野生型菌株可以釋放1-2g/L的堿性細(xì)胞外蛋白酶（XPR2）

二、酵母載體

1、概念：攜帶外源基因在酵母細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增和表達(dá)的載體，包括克隆載體和表達(dá)載體

2、組成元件：選擇標(biāo)記、調(diào)控序列

1）選擇標(biāo)記：選擇標(biāo)記是載體轉(zhuǎn)化酵母時(shí)篩選轉(zhuǎn)化子所必須的元件，用于重組子的篩選和鑒定，并且通常是顯性，營(yíng)養(yǎng)缺陷或自選標(biāo)記。選擇標(biāo)記的消除可使用Cre-loxP系統(tǒng)。（Cre/loxP系統(tǒng)可以在細(xì)胞水平上用Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，通過(guò)識(shí)別loxP位點(diǎn)將抗性標(biāo)記基因切除）。選擇標(biāo)記可分為兩類：

a.營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記：如HIS3，HIS4，LEU2，LYS2，TRP1，URA3等；

b.抗生素篩選標(biāo)記：氯霉素，G418，Zeocin等；

在釀酒酵母和乳酸克魯維酵母，LEU2基因和G418抗性基因是最常用，對(duì)于解脂耶氏酵母，主要使用LEU2和URA3基因。在畢赤酵母中，最常使用HIS4和zeocin。

2）調(diào)控序列：包括啟動(dòng)子、ARS（酵母復(fù)制起始區(qū)）、2μM質(zhì)粒、酵母著絲粒區(qū)段(CEN)等

①啟動(dòng)子：可分為兩類，組成型啟動(dòng)子提供簡(jiǎn)單性和相對(duì)恒定的表達(dá)水平，而當(dāng)需要分離生長(zhǎng)和生產(chǎn)時(shí)通常使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，這能防止無(wú)意中選擇生長(zhǎng)較快的非重組細(xì)胞或產(chǎn)生毒性蛋白。不同的受體細(xì)胞常用的啟動(dòng)子如表中所示, PGK(磷酸甘油激酶)、GAP(3-磷酸甘油醛脫氫酶)、ADH(醇脫氫酶)，G3P（甘油醛3-磷酸脫氫酶），ICL1（異檸檬酸裂合酶），ADH3啟動(dòng)子（醇脫氫酶），AOX1（醇氧化酶1），TEF（轉(zhuǎn)錄延伸因子EF-1a），GAL1（半乳糖激酶）等都是常用的啟動(dòng)子。

釀酒酵母中，半乳糖誘導(dǎo)的GAL1和GAL10啟動(dòng)子常用；在乳酸克魯維酵母中，經(jīng)常依賴于釀酒酵母的啟動(dòng)子，例如GAL1或PGK；畢赤酵母常用甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子AOX1

②ARS：酵母復(fù)制起始區(qū)(點(diǎn))

③2μM質(zhì)粒：酵母核質(zhì)中的小的環(huán)狀DNA，可以獨(dú)立復(fù)制并轉(zhuǎn)錄

④酵母著絲粒區(qū)段(CEN):?增加轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性

3、酵母載體的類型（3類）

包括酵母克隆載體、酵母表達(dá)載體以及酵母人工染色體(YAC)

1).酵母克隆載體：不含酵母啟動(dòng)子，不能在酵母中表達(dá)外源基因，可分為兩類

a.酵母整合型質(zhì)粒( yeast integrated plasmid. YIp):帶有一個(gè)酵母URA3標(biāo)志基因和大腸桿菌的復(fù)制和報(bào)告基因。由于質(zhì)粒DNA與酵母基因組DNA之間發(fā)生了同源重組，在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中可以檢測(cè)到質(zhì)粒的整合復(fù)制，轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)化率極低。

b.酵母復(fù)制型質(zhì)粒(Yeast replicable plasmid, YRp):該類載體在酵母中可以自我復(fù)制，主要有YRp、YEp和YCp

酵母復(fù)制質(zhì)粒（YRp）：細(xì)茵質(zhì)粒DNA+酵母遺傳標(biāo)記+酵母復(fù)制序列(ARS),可自主復(fù)制，但穩(wěn)定性差

酵母附加型質(zhì)粒（YEp）:細(xì)菌質(zhì)粒DNA+酵母標(biāo)記基因+酵母2 μM質(zhì)粒，游離于核外存在并自主復(fù)制，穩(wěn)定性好。2μm質(zhì)粒含有自主復(fù)制起始區(qū)(ori)和STB區(qū)，STB序列能夠使質(zhì)粒在供體細(xì)胞中維持穩(wěn)定

酵母著絲粒質(zhì)粒（YCp）：該載體除含復(fù)制起點(diǎn)外，還有酵母菌染色體著絲粒（CEN），因而能在染色體外自我復(fù)制，拷貝數(shù)低但很穩(wěn)定，適合作亞克隆載體和構(gòu)建酵母菌基因組DNA文庫(kù)

YIp:帶有一個(gè)酵母標(biāo)志基因；

YRp：在YIp的基礎(chǔ)上添加酵母復(fù)制序列(ARS)；

YEp:在YIp的基礎(chǔ)上添加酵母2μM質(zhì)粒

2）酵母表達(dá)載體 ：含酵母啟動(dòng)子，酵母表達(dá)系統(tǒng)的載體一般是穿梭質(zhì)粒，能在酵母菌和大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制。

釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)中重組蛋白的生產(chǎn)可以使用三種類型的載體完成：整合質(zhì)粒（YIp），附加型質(zhì)粒（YEp）和著絲粒質(zhì)粒（YCp）。在非常規(guī)酵母中，質(zhì)粒選擇受到更多限制。雖然質(zhì)?？捎糜谌N非常規(guī)酵母，但它們的拷貝數(shù)往往較低，并且易突變。因此，基因組整合仍是首選。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的包括分泌表達(dá)載體和非分泌型表達(dá)載體兩種

畢赤酵母分泌表達(dá)載體

pPICZα A、B 和 C 載體用于表達(dá)和分泌畢赤酵母中的重組蛋白，可用于任何畢赤酵母菌株，包括 X-33、SMD1168H 和 KM71H等。

pPICZα 載體包含以下元素：

? AOX1 啟動(dòng)子，對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控，保證甲醇誘導(dǎo)表達(dá)

? 用于重組蛋白分泌的α-因子分泌信號(hào)

? Zeocin 基因用于大腸桿菌和畢赤酵母中的篩選

含有 c-myc 抗原決定簇和(6xHis) 標(biāo)簽的 C 端肽用于檢測(cè)和純化重組融合蛋白

畢赤酵母非分泌型表達(dá)載體：

pGAPZ A，B，和C載體（2.9 KB）使用GAP啟動(dòng)子在畢赤酵母中穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白。GAP啟動(dòng)子的重組蛋白表達(dá)水平略高于AOX1啟動(dòng)子。與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對(duì)比，組成型啟動(dòng)子可以利用更多的碳源在畢赤酵母中表達(dá)外源蛋白。重組蛋白表達(dá)為帶有C端His標(biāo)簽的融合蛋白。Zeocin（博萊霉素）的篩選標(biāo)記可以同時(shí)使用于畢赤酵母和大腸桿菌。

3）酵母人工染色體

酵母人工染色體（YAC），是一種能夠克隆長(zhǎng)達(dá)400Kb的DNA片段的載體，含有酵母細(xì)胞中必需的端粒、著絲點(diǎn)和復(fù)制起始序列，是細(xì)胞內(nèi)具有遺傳性質(zhì)的物體，易被堿性染料染成深色，所以叫染色體

特點(diǎn)：容量大（50-1000kb),穩(wěn)定性差

作用：用于構(gòu)建基因組文庫(kù)

酵母中復(fù)制的必需元件包括自主復(fù)制序列（ARS）、用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒（CEN）和兩個(gè)端粒（TEL）

端粒重復(fù)序列（TEL）：定位于染色體末端一段序列，用于保護(hù)線狀的DNA 不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

著絲粒（CEN）：有絲分裂過(guò)程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過(guò)程中能正確分配到子細(xì)胞中。在 YAC 中起到保證一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)人工染色體的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。

自主復(fù)制序列（ARS）：一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的信號(hào)

在YAC載體中最常用的是pYAC4 。由于酵母的染色體是線狀的，因此其在工作狀態(tài)也是線狀的。但是，為了方便制備YAC載體，YAC載體以環(huán)狀的方式存在，并增加了普通大腸桿菌質(zhì)粒載體的復(fù)制元件和選擇標(biāo)記。

三、酵母表達(dá)系統(tǒng)中的翻譯后修飾

在酵母中，最常見(jiàn)的翻譯后修飾包括乙酰化，酰胺化，羥基化，甲基化，N-糖基化，O-糖基化，磷酸化，吡咯烷酮羧酸，硫酸化和泛素化

釀酒酵母已知會(huì)添加200個(gè)甘露糖殘基，導(dǎo)致蛋白的超糖基化，與釀酒酵母相比，畢赤酵母的糖基化程度下降。為了克服糖基化的類型和程度，已報(bào)道通過(guò)基因修飾畢赤酵母創(chuàng)建一個(gè)類似于哺乳動(dòng)物宿主的糖基化模式。在乳酸克魯維酵母中，N-糖基化過(guò)程加了大約30個(gè)甘露糖殘基。因此，與釀酒酵母相比，當(dāng)乳酸克魯維酵母用作宿主時(shí)，重組蛋白的免疫原性較低。

四、轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化方法常用的有三種：具體如下

1.電穿孔法：效率較高，整合型載體轉(zhuǎn)化前要酶切線性化

2.LiCl法：做成感受態(tài)細(xì)胞

3、原生質(zhì)體法：去除厚壁

參考文獻(xiàn)：

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