RNA測(cè)序（RNA-seq）是轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的重要工具，也是生命科學(xué)領(lǐng)域最常用的技術(shù)之一。相比于傳統(tǒng)通路研究低維度、低通量的局限性，轉(zhuǎn)錄組學(xué)有以下優(yōu)勢(shì)：1）能夠動(dòng)態(tài)考察細(xì)胞基因組的表達(dá)，多維度地反映差異變化；2）可用于研究占RNA絕大部分的非編碼RNA，研究其結(jié)構(gòu)以及在細(xì)胞生命活動(dòng)中的重要調(diào)控作用；3）與蛋白組學(xué)研究相互補(bǔ)充，更全面地呈現(xiàn)細(xì)胞水平的變化信息。作為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的技術(shù)基礎(chǔ)，RNA測(cè)序技術(shù)也在不斷地更新迭代。本文將對(duì)第一代至第三代測(cè)序技術(shù)的原理和特點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)要的介紹。注：除Direct-Seq外的測(cè)序技術(shù)都涉及到DNA鏈的合成，當(dāng)用于RNA測(cè)序時(shí)，會(huì)先通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）合成cDNA文庫，再進(jìn)行測(cè)序。

第一代測(cè)序技術(shù)（Sanger Method）

第一代測(cè)序技術(shù)由Fred Sanger提出，被稱為Sanger Method，是分子測(cè)序領(lǐng)域“從無到有”的重大突破。此方法基于常規(guī)的PCR技術(shù)以及特殊的原料ddNTP（雙脫氧核苷三磷酸）。在PCR擴(kuò)增時(shí)，四種ddNTP分別被加入體系中，由于ddNTP缺少3’-OH基團(tuán)，不具備形成磷酸二酯鍵的能力，理論上可以終止在模板鏈上的任意位置。此外,這些ddNTP上連接有放射性同位素標(biāo)記，通過凝膠電泳分離后可被凝膠成像系統(tǒng)所檢測(cè)并分析（圖1）?；谶@一方法也開發(fā)出了能夠自動(dòng)化熒光測(cè)序的儀器（圖2）。由于一代測(cè)序技術(shù)步驟繁瑣耗時(shí)，測(cè)序通量低，讀長(zhǎng)短且成本高昂，無法滿足目前組學(xué)研究的需求。

圖1 | Sanger Method的基本原理和流程圖

圖2 |?基于Sanger Method的自動(dòng)化熒光測(cè)序技術(shù)

第二代測(cè)序技術(shù)（Short Read RNA-seq）

第二代測(cè)序技術(shù)在測(cè)序方法上取得了重大突破，基于“邊合成邊測(cè)序”（sequencing by synthesis）和大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)（massive parallel analysis,MPS），使測(cè)序通量和讀取速度得到極大提升，其中最具代表性的是Illumina Solexa測(cè)序儀。Illumina的測(cè)序原理可以簡(jiǎn)化為四步：樣品文庫構(gòu)建、簇生成、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。由于讀長(zhǎng)限制，樣品DNA或由RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA需要被打斷成300-500bp的片段，并在3'和5'端接上3種序列：1）Index，用于區(qū)分樣品來源；2）Adapter，用于結(jié)合測(cè)序通道上的位點(diǎn)；3）Primer binding site，用于結(jié)合PCR引物啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)?；跇蚴絇CR技術(shù)的簇生成可以將模版鏈迅速擴(kuò)增成千上萬倍，保證過程中足夠的測(cè)序深度。測(cè)序時(shí)使用特殊標(biāo)記的dNTP：1）堿基上通過敏感鍵修飾上不同的熒光基團(tuán)，用于區(qū)分ATCG；2）3'端使用疊氮基團(tuán)封閉，保證一次循環(huán)只上一個(gè)dNTP（圖3）。每一輪循環(huán)結(jié)束時(shí)，會(huì)通過高速熒光顯微鏡記錄熒光圖像，再通入試劑除去熒光基團(tuán)和疊氮基團(tuán)，開啟下一循環(huán)。通過分析讀取同一位點(diǎn)的熒光，實(shí)時(shí)獲取模版鏈的堿基序列。由于過程中使用的化學(xué)反應(yīng)并不可控，隨著循環(huán)數(shù)的增大會(huì)出現(xiàn)不同步的情況，因此Illumina的讀長(zhǎng)只能限制在200bp左右。但由于極高的測(cè)序通量和準(zhǔn)確率，Illumina仍占有目前最高的市場(chǎng)份額。

圖3?|?Illumina技術(shù)原理示意圖

第三代測(cè)序技術(shù)（Long Read RNA-seq）

由于Illumina測(cè)序前需要事先將樣本鏈打碎，測(cè)序后通過軟件去還原完整的序列，而且單次讀長(zhǎng)限制在200bp以內(nèi)，在做全轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)可能會(huì)丟失相當(dāng)一部分信息，而第三代測(cè)序技術(shù)恰恰彌補(bǔ)了這一短板。第三代技術(shù)有兩種：1）單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（SingleMolecular Real-Time Sequencing，SMRT），仍需要RT-PCR構(gòu)建cDNA文庫，代表是Pracific Bioscience測(cè)序儀；2）直接測(cè)序技術(shù)（DirectRNA-seq），代表是OxfordNanopore測(cè)序儀。

1. SMRT：PracificBiosciences

SMRT技術(shù)無需打碎樣品，通過在模板兩端接上Adapter構(gòu)建成環(huán)形DNA分子。Pracific Biosciences測(cè)序儀的工作池中含有成千上萬個(gè)微孔，一個(gè)微孔只能裝載一個(gè)DNA-聚合酶復(fù)合物（圖4）。與二代技術(shù)不同，SMRT使用的dNTP的熒光基團(tuán)修飾在5’的三磷酸上，當(dāng)磷酸二酯鍵形成后，熒光基團(tuán)淬滅離去。將高速熒光顯微攝像機(jī)和低穿透性的激光相結(jié)合，dNTP通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合到模板鏈上的瞬間產(chǎn)生熒光信號(hào)被捕獲，合成后信號(hào)淬滅，保證一次僅讀取一個(gè)堿基。SMRT容易產(chǎn)生錯(cuò)讀，錯(cuò)誤率約為12.5%，但所幸誤差是隨機(jī)的，利用此平臺(tái)的Circular Consensus Sequencing模式對(duì)單個(gè)分子反復(fù)測(cè)序，即可得到高保真的序列信息（準(zhǔn)確率>99.9%），但此模式會(huì)進(jìn)一步消耗測(cè)序通量，使得測(cè)序深度過低。SMRT的另一個(gè)模式Continuous Long Read則是專門用于超長(zhǎng)序列（可至50k bp）的讀取。由于無需打碎，SMRT技術(shù)簡(jiǎn)化了樣品處理流程，且能夠?qū)崿F(xiàn)超長(zhǎng)序列的完整分析，方便用于全轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析研究。

圖4?|?Pacific Biosciences測(cè)序儀

2.?Direct RNA-seq：Oxford Nanopore

由于前幾代技術(shù)用于RNA測(cè)序都要通過RT-PCR構(gòu)建cDNA文庫，使樣品準(zhǔn)備流程繁瑣，且會(huì)引入一定的系統(tǒng)誤差。此外，前幾代技術(shù)都無法用于堿基修飾、mRNA的5’-甲基鳥苷帽以及3’-腺苷尾的研究。而Oxford Nanopore測(cè)序儀的問世完美解決了上述的問題。Nanopore的關(guān)鍵技術(shù)有三：1）納米孔：來源于天然的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并經(jīng)過人工改造，是核酸鏈的測(cè)序通道；2）高電阻聚合物膜：錨定納米孔蛋白，并保證測(cè)序時(shí)電流只能從納米孔通過；3）動(dòng)力蛋白：結(jié)合核酸并將其拖送至納米孔，用于DNA測(cè)序的動(dòng)力蛋白還兼具DNA解旋酶的功能（圖5）。當(dāng)動(dòng)力蛋白-核酸復(fù)合體結(jié)合到納米孔上時(shí)，測(cè)序開始：核酸鏈逐個(gè)堿基地通過納米孔，由于四種堿基的電荷差異，會(huì)引起膜孔處不同的電流變化。電流信號(hào)經(jīng)放大后被系統(tǒng)收集，通過軟件算法實(shí)時(shí)翻譯為核苷酸序列。由于堿基修飾后（如甲基化、乙?；龋┩ㄟ^納米孔的速度以及產(chǎn)生的電流大小都會(huì)發(fā)生變化，因此Nanopore可被用于堿基修飾測(cè)序。此外，Nanopore可以直接讀取mRNA 3’-腺苷尾的長(zhǎng)度，這為信使RNA剪接成熟機(jī)制以及穩(wěn)定性的研究提供了有力工具。

Nanopore技術(shù)不僅大大簡(jiǎn)化了樣品的準(zhǔn)備流程，其最大的突破在于便攜性的提升和檢測(cè)成本的大幅優(yōu)化。一些系列的設(shè)備僅有USB驅(qū)動(dòng)器大小，2016年7月，一臺(tái)MiniON測(cè)序儀搭乘SpaceX 9號(hào)進(jìn)入到國(guó)際空間站，首次在太空微重力下完成了測(cè)序。此外，Nanopore大幅降低測(cè)序成本至僅萬元水平。核酸測(cè)序技術(shù)，作為曾經(jīng)大型機(jī)構(gòu)的“堂前燕”，逐漸飛入了普通科研院所的“百姓家”。

圖5 | Oxford Nanopore測(cè)序技術(shù)

總結(jié)

至此，三代測(cè)序技術(shù)已介紹完畢。三代技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)如圖（圖6）。我們傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法多是熒光半定量、ELISA和WesternBlotting等，所能提供的信息有限且可能存在一定的偏向性。相比而言，RNA測(cè)序技術(shù)可以為我們的工作提供多維度的信息作為補(bǔ)充，也能夠給予研究更多的可靠性。隨著測(cè)序成本的不斷降低，RNA測(cè)序也將更加地普及，這對(duì)藥學(xué)工作者來說也將是一個(gè)“福音”。

圖6 |?幾代測(cè)序技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)

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