前列腺癌(prostate cancer，PC) 是男性癌癥相關(guān)死亡的重要原因。雄激素阻斷療法是治療復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性患者的主要治療方法，但幾乎所有患者在雄激素阻斷療法開(kāi)始后的幾年內(nèi)都會(huì)進(jìn)入所謂雄激素阻斷療法抗性期，即雄激素阻斷療法抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）。

近期哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的黃小義教授團(tuán)隊(duì)在雄激素阻斷療法抗性前列腺癌產(chǎn)生機(jī)制和治療手段方面取得了重要的進(jìn)展。作者團(tuán)隊(duì)在之前的研究中發(fā)現(xiàn)miR-375在雄激素阻斷療法抗性前列腺癌病人血漿外泌體中明顯增多。在這項(xiàng)工作中，作者發(fā)現(xiàn)miR-375通過(guò)調(diào)控PTPN4表達(dá)穩(wěn)定了STAT3磷酸化，促進(jìn)了前列腺癌的發(fā)展。基于此，作者提出利用miR-375反義寡核苷酸序列治療CRPC的可能性并進(jìn)行了初步驗(yàn)證，為相關(guān)疾病的治療提供了重要的靶點(diǎn)。該成果于2022年8月發(fā)表于國(guó)際著名期刊《Experimental & Molecular Medicine》(IF=12.153)雜志上。

值得一提的是，該項(xiàng)研究使用了漢恒生物提供的miRNA過(guò)表達(dá)和敲低慢病毒載體，同時(shí)在敲低PTPN4的實(shí)驗(yàn)中也使用了漢恒提供的siRNA。這些工具在miR-375功能驗(yàn)證中起到了重要作用。

基于作者團(tuán)隊(duì)此前的研究，他們首先觀察了miR-375在前列腺癌中的表達(dá)。結(jié)果顯示，相較于癌旁組織或正常組織，癌組織中的miR-375表達(dá)明顯增高。

圖1. MiR-375在前列腺癌中的表達(dá)

為了進(jìn)一步探究miR-375高表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞的影響，作者嘗試在兩種人前列腺癌細(xì)胞系DU145和PC-3中上調(diào)和下調(diào)miR-375。首先作者借助購(gòu)自漢恒生物的miRNA過(guò)表達(dá)載體pSUPER-RETRO-Puro-miR-375在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-375，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力、遷移能力都得到了增強(qiáng)，并且凋亡顯著減少。作者接著又使用了漢恒生物的miRNA封閉載體，pHB-U6-MCS-PGK-PURO-miR-375 sponge載體，，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)降低，而凋亡標(biāo)記升高了。這說(shuō)明miR-375的高表達(dá)能提高前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，但抑制其凋亡。

圖2. MiR-375促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，但抑制凋亡

為了揭示miR-375促進(jìn)前列腺癌的機(jī)制，作者借助miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)工具，預(yù)測(cè)了miR-375的潛在靶點(diǎn)。作者對(duì)其中部分基因進(jìn)行了驗(yàn)證，并發(fā)現(xiàn)其靶點(diǎn)之一，PTPN4基因，在前列腺癌組織中表達(dá)顯著下降，并和miR-375的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，因此作者認(rèn)為它可能是miR-375的靶點(diǎn)。利用前述的方法在細(xì)胞中敲低和過(guò)表達(dá)miR-375，PTPN4的表達(dá)量也會(huì)相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)。這說(shuō)明，PTPN4是miR-375的靶基因，miR-375通過(guò)結(jié)合其RNA抑制其表達(dá)。

圖3. 在前列腺癌中，MiR-375靶向并負(fù)調(diào)控PTPN4

既然PTPN4是miR-375的靶基因，那么miR-375是否通過(guò)它來(lái)促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展呢？作者在細(xì)胞系中通過(guò)過(guò)表達(dá)PTPN4發(fā)現(xiàn)，PTPN4的高表達(dá)能有效抑制癌細(xì)胞增殖和遷移，并增加了其凋亡水平。而且在過(guò)表達(dá)miR-375的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)PTPN4能有效抑制miR-375對(duì)癌細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用。通過(guò)分析PTPN4下游通路，作者還發(fā)現(xiàn)了PTPN4影響了STAT3的磷酸化。因此，miR-375主要通過(guò)調(diào)控PTPN4-STAT3通路來(lái)調(diào)控前列腺癌的發(fā)展。

圖4. MiR-37過(guò)表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和抑制凋亡的作用依賴于PTPN4-STAT3通路。

為了進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證miR-375的作用，作者通過(guò)異體移植的方法將DU145細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)并觀察其生長(zhǎng)。作者發(fā)現(xiàn)miR-375過(guò)表達(dá)的細(xì)胞在體內(nèi)成瘤更大，更容易遷移，而miR-375敲低的細(xì)胞則成瘤更小，不易遷移。則進(jìn)一步在體內(nèi)水平驗(yàn)證了miR-375對(duì)前列腺癌的促進(jìn)作用。

圖5. 體內(nèi)過(guò)表達(dá)MiR-375促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

在清楚miR-375的作用機(jī)制后，作者進(jìn)一步希望能尋找相關(guān)的治療方法。于是作者嘗試?yán)梅戳xPMO（Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotides）e-375i抑制miR-375的功能。結(jié)果顯示，e-375i能有效抑制DU145細(xì)胞的增殖和遷移，并增加了其凋亡。這說(shuō)明e-375i可作為潛在的前列腺癌治療手段。

圖6. 在DU145細(xì)胞中，E-375i抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)其凋亡

接著作者在體內(nèi)驗(yàn)證了e-375i的效果。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)e-375i能在體內(nèi)有效抑制腫瘤的發(fā)展，使用e-375i后，miR-375表達(dá)下降，腫瘤明顯減小。這進(jìn)一步說(shuō)明了e-375i的治療潛力。

圖7. 體內(nèi)注射E-375i抑制前列腺癌增殖

為了進(jìn)一步解析miR-375的作用機(jī)制，作者繼續(xù)探究了PTPN4-STAT3通路的下游因子。由于雄激素受體（androgen receptor，AR)是PTPN4-STAT3通路的下游因子，并是前列腺癌產(chǎn)生雄激素阻斷療法抗性的重要因子，作者就希望知道m(xù)iR-375對(duì)AR有什么影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-375通過(guò)PTPN4-STAT3通路調(diào)控了AR的表達(dá)：miR-375高表達(dá)促進(jìn)了AR的高表達(dá)，促進(jìn)了前列腺癌的發(fā)生，進(jìn)而可能導(dǎo)致了對(duì)雄激素阻斷療法的抗性。

圖8. MiR-375通過(guò)靶向PTPN4-STAT3信號(hào)通路調(diào)控AR的表達(dá)

針對(duì)雄激素阻斷療法抗性的前列腺癌病人，作者推測(cè)通過(guò)抑制miR-375或可抑制其抗性。因此作者通過(guò)敲低miRNA-375并聯(lián)合使用雄激素受體抑制劑enzalutamide，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種方法能有效的抑制腫瘤大小。這提示我們可以使用類(lèi)似的手段治療雄激素阻斷療法抗性前列腺癌。

圖9. MiR-375通過(guò)靶向PTPN4-STAT3信號(hào)通路在體外和體內(nèi)調(diào)控enzalutamide耐藥

經(jīng)過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，作者揭示了miR-375通過(guò)PTPN4-STAT3通路促進(jìn)前列腺癌發(fā)生和產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制。并且作者驗(yàn)證了miR-375作為治療靶點(diǎn)的巨大潛力，為相關(guān)前列腺癌病人的治療提供了重要的思路。