新型冠狀病毒（SARS-CoV-2，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2）的人類傳播是新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）大流行的致病性病原體，給人類健康和社會經(jīng)濟都帶來了巨大危機。目前研究發(fā)現(xiàn)該病毒會感染肺泡上皮2型細胞（AT2s），引起肺損傷和氣體交換受損，但其感染和病理機制尚不清楚。

2020年12月17日，來自美國波士頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究團隊在CELL子刊Molecular Cell（IF 15.584）雜志上發(fā)表題目為"Actionable Cytopathogenic Host Responses of Human Alveolar Type 2 Cells to SARS-CoV-2"的研究成果，研究人員對感染SARS-CoV-2的iAT2s（誘導(dǎo)多能干細胞衍生的AT2s）進行了深入的定量時間磷酸化/蛋白質(zhì)組分析，以定量分析在四個時間點（1、3、6、24 hpi）由iAT2s中SARS-CoV-2感染引起的細胞病理學(xué)變化，揭示宿主細胞信號傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)表達譜，進一步將該工作與永生細胞系的先前研究進行了比較，系統(tǒng)級的預(yù)測病毒對肺細胞的影響以及哪些藥物可以減慢感染速度。

研究材料：感染（實驗組）和未感染（對照組）SARS-CoV-2的誘導(dǎo)多能干細胞衍生的肺泡上皮2型細胞（iAT2）；4個時間點：1、3、6、24 hpi。

技術(shù)方法：TMT蛋白組學(xué)和TMT磷酸化蛋白組學(xué)

實驗方法簡介：

步驟1：構(gòu)建模型：肺部感染的病理生理模型；

步驟2：病毒感染iAT2s的定量時間質(zhì)譜分析（蛋白組+磷酸化蛋白組）；

步驟3：宿主蛋白質(zhì)組受到病毒感染的影響；

步驟4：分子支架解釋肺細胞反應(yīng)；

步驟5：磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)揭示失調(diào)的途徑；

步驟6：與SARS-CoV-2感染相關(guān)的功能網(wǎng)絡(luò)；

步驟7：抗病毒藥靶預(yù)測及驗證；

步驟8：病毒感染后的分子反應(yīng)圖譜。

研究結(jié)果：

1、構(gòu)建模型：肺部感染的病理生理模型

通過定向分化從人多能干細胞（iPSC）系SPC2-ST-B2生成了iAT2，然后對表達tdTomato熒光報告基因的細胞進行分選，分離出純度>95％的AT2樣細胞。iAT2最初以3D肺泡球培養(yǎng)，然后播種在Transwell插入片段上產(chǎn)生ALI（空氣-液體界面）培養(yǎng)物，以允許細胞從頂端表面感染。為了闡明受SARS-CoV-2影響的宿主系統(tǒng)，研究人員用新冠肺炎病毒感染iAT2 ALI培養(yǎng)物。免疫熒光分析（IFA）證實，感染后24 hpi的感染率約為20％。

2、病毒感染iAT2s的定量時間質(zhì)譜分析

利用TMT定量蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組對感染后的iAT2s （4個時間點：1、3、6、24 hpi）進行檢測分析，總共定量了8,471種蛋白質(zhì)（包括8種病毒蛋白）和14,289個磷酸位點（位于2個病毒蛋白和2,703個宿主的磷酸化蛋白上），檢測到2,872個顯著蛋白（|log2 FC|>0.25，F(xiàn)DR<0.05），包括對表面活性劑功能至關(guān)重要的AT2標記，如SFTPA2。同時， 4,688個磷酸化位點發(fā)生改變（|log2 FC|>0.25，F(xiàn)DR<0.05），它們定位在1,166種獨特的肺部蛋白上（許多與肺細胞功能的調(diào)節(jié)劑相對應(yīng)，包括蛋白激酶、磷酸酶、銜接子和轉(zhuǎn)錄因子）。

3、宿主蛋白質(zhì)組受到病毒感染的影響

為了表征初始iAT2宿主對感染的反應(yīng)，研究人員對不同時間點（1-6 hpi）差異蛋白進行監(jiān)督聚類發(fā)現(xiàn)了四個不同的Cluster，分別對應(yīng)于接種（~1 hpi）、早期（~3 hpi）和中/晚期（3-6 hpi）宿主蛋白表達波動。Cluster 1與病毒進入（峰值~1 hpi）的快速反應(yīng)相關(guān)，富含先前與病毒感染和免疫相關(guān)的因子，包括TRAF6介導(dǎo)的細胞因子誘導(dǎo)、NF-kB活化和C型凝集素受體的標記物。Cluster 2-4 （3–6 hpi） 富含與細胞增殖調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括檢查點激酶調(diào)節(jié)劑ATR和細胞死亡效應(yīng)因子CASP7/8的失調(diào)和有絲分裂檢查點調(diào)節(jié)劑BUB1B，提示細胞周期停滯。

與該觀察結(jié)果一致，免疫熒光染色實驗揭示出SARS-CoV-2感染的iAT2s中PCNA表達明顯降低，表明病毒誘導(dǎo)的間期阻滯。從感染的時間過程中出現(xiàn)了連貫的模式，反映出明顯的功能富集。在24 hpi，檢測到八個不同的病毒蛋白（S、M、N、Orf3a/7a/8/9b，以及映射到多蛋白Rep1a的多個成分）。在感染SARS-CoV-2的Caco-2細胞中發(fā)現(xiàn)了相同的病毒蛋白，表明Rep1a的結(jié)構(gòu)蛋白表達豐富，并通過蛋白水解產(chǎn)生優(yōu)先蛋白。

4、分子支架解釋肺細胞反應(yīng)

SARS-CoV-2編碼與宿主因子相互作用的蛋白酶、聚合酶和其他效應(yīng)子。為了表征感染期間可能在iAT2中發(fā)生哪些的病毒-宿主蛋白-蛋白相互作用（PPI），研究人員將蛋白質(zhì)組學(xué)時程數(shù)據(jù)疊加到了最近報道的SARS-CoV-2分子關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)上，以此推斷這些關(guān)聯(lián)的動力學(xué)。在感染的iAT2中觀察到了許多不同病毒效應(yīng)子的假定宿主靶點的時間過程曲線存在顯著差異。隨著病毒復(fù)制的增加，在3-6 hpi時，很大一部分相互作用的肺蛋白受到了病毒的影響，這意味著其中一些變化是由病毒效應(yīng)子結(jié)合引起的。病毒介導(dǎo)的不穩(wěn)定可能破壞中心體-微管網(wǎng)絡(luò)的重組，導(dǎo)致24 hpi所見的細胞周期停滯。相反，響應(yīng)SARSCoV-2感染而上調(diào)的宿主蛋白更有可能與病毒效應(yīng)子形成穩(wěn)定的功能單元。

5、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)揭示失調(diào)的途徑

研究者針對病毒感染過程中磷酸化信號調(diào)控進行深入分析：分析24 hpi的病毒膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）上的磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)核衣殼蛋白（N）上有9個獨特的磷酸化位點被嚴重修飾，聚集在RNA結(jié)合（RBD）和二聚化結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)，而病毒膜蛋白（M）的C端細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的S213/S214被磷酸化修飾。進一步實驗表明宿主激酶引起的病毒核衣殼蛋白（N）磷酸化可調(diào)節(jié)相分離，從而影響RNA組裝和包裝。利用差異宿主磷酸化蛋白的監(jiān)督聚類和通路分析揭示iAT2細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的整體變化，宿主激酶網(wǎng)絡(luò)分析確定SARS-CoV-2影響iAT2s中的Ser/Thr/Tyr激酶。進一步分析并經(jīng)實驗證實，SARS-CoV-2具有重塑細胞的生長、感染重排宿主mRNA剪接、破壞核完整性的功能。

6、與SARS-CoV-2感染相關(guān)的功能網(wǎng)絡(luò)

為了探索SARSCoV-2感染改變肺泡的途徑和過程，對差異蛋白和磷酸化蛋白譜進行了富集分析，再將FDR<0.1的結(jié)果合并到基于共享組件的更高級別的模塊中，發(fā)現(xiàn)代謝相關(guān)途徑受到顯著影響，包括脂肪酸代謝改變、線粒體呼吸作用和嘧啶核苷酸生物合成。這些結(jié)果表明宿主代謝發(fā)生重編程，有利于能量和生物質(zhì)合成，以支持病毒復(fù)制。

7、抗病毒藥靶預(yù)測及驗證

為了探索本數(shù)據(jù)的治療潛力，研究人員檢測了不同的iAT2宿主磷酸化/蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，以確定潛在的脆弱點，然后在每個時間點的病毒應(yīng)答關(guān)聯(lián)子網(wǎng)絡(luò)中推斷出可能的藥靶。最終從7,000多種批準的藥物中挑選了31種小分子抑制劑進行測試，只有KN-93（CAMK2的選擇性抑制劑）和結(jié)核菌素在Vero E6和iAT2中均能有效抑制SARS-CoV-2復(fù)制。另外還有4種抑制劑（levofloxacin、FRAX486、losmapimod和AZ20）在iAT2s中有效抑制病毒復(fù)制，而在Vero E6細胞中顯示無效或弱效（<10％抑制），其中對MAP激酶抑制劑losmapimod的研究還啟動了一項針對COVID-19的3期臨床試驗。

小編小結(jié)：

SARS-CoV-2感染破壞了正常肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)所需的分子過程，導(dǎo)致肺功能受損。闡明病毒在固有肺泡環(huán)境中劫持的細胞途徑對于理解發(fā)病機制和設(shè)計治療是至關(guān)重要的。為此，研究人員將人原代類AT2細胞與磷酸化/蛋白質(zhì)組學(xué)時程分析相結(jié)合，證明了宿主對肺泡上皮細胞感染的不同反應(yīng)。該方法繪制了早期感染、病毒顆粒形成前以及以顯性病毒復(fù)制為特征的后期階段的iAT2反應(yīng)，表明隨著病毒破壞宿主程序并重新連接模塊，動態(tài)疾病特征會發(fā)生演變。該研究全面解析了新冠肺炎病毒感染機制，也為疾病治療策略提供了新的見解。

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