? ? ? ?今天介紹的是唯一的植物雙鏈DNA病毒——花椰菜花葉病毒。

簡介

? ? ? 花椰菜花葉病毒(Cauliflower Mosaic Virus，CaMV)是花椰菜病毒家族(卡利莫病毒/Caulimovirus)的成員，是感染植物的擬逆轉(zhuǎn)錄病毒。擬逆轉(zhuǎn)錄病毒像逆轉(zhuǎn)錄病毒一樣通過逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制，但病毒顆粒含有DNA而不是RNA。

病毒宿主

? ? ? ?CaMV主要感染十字花科植物(如花椰菜和蘿卜)，但一些CaMV毒株(D4和W260)也能夠感染曼陀羅和煙草屬的茄科物種。CaMV誘導(dǎo)多種全身癥狀，例如花葉、葉表面壞死病變、生長發(fā)育遲緩和整個植物結(jié)構(gòu)的變形。 表現(xiàn)出的癥狀因病毒株、宿主生態(tài)型和環(huán)境條件而異。?

? ? ? CaMV由桃蚜等蚜蟲以非循環(huán)方式傳播。 一旦被引入植物宿主細(xì)胞，病毒粒子就會遷移到植物細(xì)胞的核膜上。

結(jié)構(gòu)

? ? ? ?CaMV粒子是一個直徑為52 nm的二十面體，由420個衣殼蛋白(CP)亞基構(gòu)成，這些亞基以三角剖分T=7排列，圍繞著充滿溶劑的中心腔。

? ? ? ?CaMV包含一個8024bp的環(huán)狀雙鏈DNA分子，被逆轉(zhuǎn)錄過程中RNaseH作用產(chǎn)生的切口打斷。 這些缺口來自tRNA-fMet和用于逆轉(zhuǎn)錄的兩個RNA引物。進(jìn)入宿主細(xì)胞后，病毒DNA中的這些單鏈“缺口”被修復(fù)，形成與組蛋白結(jié)合的超螺旋分子。該DNA被轉(zhuǎn)錄成全長、末端冗余的35S RNA和亞基因組19S RNA。

基因組

? ? ? 35S RNA的啟動子是一個非常強(qiáng)的組成型啟動子，負(fù)責(zé)整個CaMV基因組的轉(zhuǎn)錄。它因其在植物轉(zhuǎn)化中的用途而廣為人知。它導(dǎo)致雙子葉植物中的高水平基因表達(dá)。然而，它在單子葉植物中效果較差，尤其是在谷物中。行為的差異可能是由于監(jiān)管因素的質(zhì)量或數(shù)量不同。最近的研究表明CaMV 35S啟動子在一些動物細(xì)胞中也有功能，盡管使用的啟動子元件與植物中的不同。雖然與經(jīng)典動物啟動子相比，該啟動子的活性較低，但報(bào)告產(chǎn)物的水平很高。這一觀察結(jié)果表明35S啟動子可能具有用于動物的潛力。?

? ? ? 該啟動子因病毒轉(zhuǎn)錄本的沉降系數(shù)是35S而得名，其表達(dá)自然由該啟動子驅(qū)動。它是使用最廣泛的通用組成型啟動子之一。它是在1980 年代初由蔡和洛克菲勒大學(xué)的合作者發(fā)現(xiàn)的。

? ? ? ?35S RNA特別復(fù)雜，包含高度結(jié)構(gòu)化的600 個核苷酸長的前導(dǎo)序列和6到8個短的開放閱讀框 (ORF)。

? ? ? ?緊隨其后的是7個排列緊密、較長的ORF，這些ORF編碼所有病毒蛋白。這些蛋白的表達(dá)機(jī)制是獨(dú)一無二的，因?yàn)镺RF VI蛋白(由19S RNA編碼)控制多順反子35S RNA上主要開放閱讀框的翻譯重新啟動，這一過程通常只發(fā)生在細(xì)菌mRNA上。TAV功能取決于其與多核糖體和真核起始因子eIF3的關(guān)聯(lián)。?

ORF I – P1：運(yùn)動蛋白

ORF II – P2：蚜蟲/昆蟲傳播因子

ORF III – P3：病毒體相關(guān)蛋白(VAP)——結(jié)構(gòu)蛋白，DNA結(jié)合能力

ORF IV – P4：衣殼蛋白(CP)

ORF V – P5：Pro-Pol——蛋白酶、雙功能逆轉(zhuǎn)錄酶和RNaseH

ORF VI – P6：反式激活因子/病毒纖溶蛋白——包涵體形成/運(yùn)輸；可能還有其他功能

ORF VII/VIII – 未知(似乎感染需要注意)

包含一個tRNA-Met結(jié)合位點(diǎn)

? ? ? ? 除了在翻譯激活和包涵體形成方面的功能外，P6已被證明與許多其他CaMV蛋白相互作用，如P2和P3，表明它也可能在某種程度上有助于病毒組裝和蚜蟲介導(dǎo)的傳送。此外，P6已被證明與P7結(jié)合；研究兩者之間的相互作用可能有助于闡明P7的未知功能。?

? ? ? ? P6的另一個功能涉及在感染過程中修飾宿主非病原體相關(guān)基因1(NPR1)。NPR1是水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)依賴性信號傳導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)劑，并且與兩者之間的串?dāng)_最密切相關(guān)。NPR1 的修飾通過阻止SA依賴性信號傳導(dǎo)來抑制植物細(xì)胞的防御反應(yīng)；修飾后的NPR1可以正常運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核并結(jié)合PR-1啟動子，但無法啟動轉(zhuǎn)錄。因?yàn)镾A的積累需要活性NPR1，這會導(dǎo)致SA的進(jìn)一步消耗。P6修飾的NPR1對SA依賴性信號的調(diào)節(jié)定位于細(xì)胞核，而JA依賴性信號的調(diào)節(jié)本質(zhì)上是細(xì)胞質(zhì)的，并涉及COI1通路。與SA 相比，JA依賴性信號在修飾的NPR1存在下增加。

復(fù)制過程

CaMV通過逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制：

1.病毒顆粒進(jìn)入植物細(xì)胞并沒有衣殼化。在這個階段，病毒DNA由三個片段——α鏈、β鏈和γ鏈組成。它們不完美地組裝成具有三個缺口(D1、D2、D3)的松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)。

2.病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞核，在那里填補(bǔ)了不連續(xù)性，形成共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)。此時病毒DNA也與宿主組蛋白結(jié)合，形成微染色體。

3.宿主RNA聚合酶從35S啟動子轉(zhuǎn)錄，并繞到病毒基因組一圈，越過35S啟動子后，轉(zhuǎn)錄停止 此外，轉(zhuǎn)錄也在19S啟動子處啟動。

4.病毒RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)，在那里被翻譯。其中，35S RNA不僅能作為翻譯的模板，還是逆轉(zhuǎn)錄的模板。

5.tRNA-fMet的3'端與35S RNA的5'端附近的D1對應(yīng)的位點(diǎn)結(jié)合。

6.tRNA-fMet通過病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(由ORF V編碼)引發(fā)新α鏈的合成。

7.RNaseH從DNA-RNA雙鏈復(fù)合體中去除RNA，留下DNA。

8.新的DNA與RNA模板3'末端的35S啟動子結(jié)合，α鏈的合成繼續(xù)進(jìn)行，RNaseH繼續(xù)降解與DNA結(jié)合的RNA。

9.α鏈的合成結(jié)束，RNaseH活性在D3暴露富含嘌呤的區(qū)域，啟動γ鏈的合成。

10.RNaseH活性在D2暴露富含嘌呤的區(qū)域，啟動β鏈的合成。當(dāng)DNA的新γ鏈到達(dá)新α鏈的5'端時，它會切換到新α鏈的5'端，重新創(chuàng)建D1。當(dāng) DNA 的新 γ 鏈到達(dá)新 β 鏈的 5' 端時，它會取代引物和一些新合成的 β 鏈，導(dǎo)致D2)的重新創(chuàng)建。當(dāng)DNA的新β鏈到達(dá)新γ鏈的5'末端時，它會取代引物和一些新合成的γ鏈，導(dǎo)致D3的重新創(chuàng)建。

? ? ? ?在這一點(diǎn)上，新的病毒基因組可以被包裝到衣殼中并從細(xì)胞中釋放出來，或者它們可以通過運(yùn)動蛋白運(yùn)輸?shù)较噜彽奈锤腥炯?xì)胞中。

? ? ? ?大多數(shù)轉(zhuǎn)基因作物都使用花椰菜花葉病毒啟動子(CaMV 35S)來激活人工插入宿主植物的外源基因。它以不同于存在于其天然蕓苔屬植物宿主中時所發(fā)現(xiàn)的形式插入轉(zhuǎn)基因植物中。這使其能夠在廣泛的宿主生物環(huán)境中運(yùn)行，否則這是不可能的。

? ? ? ?CaMV包含8024 bp的雙鏈DNA基因組并產(chǎn)生球形顆粒。CaMV感染是全身性的，當(dāng)接種到磨損的植物表面時，甚至其DNA也具有感染性。CaMV基因組有8個緊密排列的基因，其中只有基因II和VII是非必需的，只有這兩個基因可以被替換/刪除而不會喪失傳染性。此外，超過自然基因組大小(8024 bp)的修飾CaMV基因組也不會被包裝到病毒粒子中。這兩個因素嚴(yán)重限制了CaMV中可克隆的DNA插入片段的大小。據(jù)悉，細(xì)菌二氫葉酸還原酶DHFR基因已成功克隆到CaMV基因組中，替代基因II，并在植物中成功表達(dá)。

載體介導(dǎo)的CaMV傳播的分子機(jī)制

? ? ? ?該病毒是在蚜蟲載體喂養(yǎng)期間從受感染的宿主獲得的。為了發(fā)生，一個可傳播的復(fù)合體由病毒粒子和位于載體探針中的蛋白質(zhì)P2組成。 P2 N端結(jié)構(gòu)域識別位于管心針尖端的蛋白質(zhì)受體，P2 C端結(jié)構(gòu)域與P3修飾的病毒粒子結(jié)合。

? ? ? 載體的獲取模式由P2的組織和細(xì)胞內(nèi)特異性定位控制。這種蛋白質(zhì)僅存在于表皮和薄壁細(xì)胞中。此外，在這些細(xì)胞中，P2位于單個病毒電子透明包涵體(ELIB)中。在宿主細(xì)胞中，病毒蛋白P2和P3首先在眾多病毒工廠(電子致密包涵體)中產(chǎn)生，然后在集中在ELIB之前輸出并與微管共定位。CaMV專門利用微管形成可傳播體，從而實(shí)現(xiàn)載體傳播。沒有進(jìn)一步對該病毒進(jìn)行完整的分子表征和研究。

逃避植物防御

? ? ? ? 花椰菜花葉病毒擁有多種機(jī)制，使其能夠抵抗宿主植物細(xì)胞的防御。雖然前基因組35S RNA負(fù)責(zé)通過逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行基因組復(fù)制，但它還包含一個非編碼的600堿基對前導(dǎo)序列，作為重要的mRNA，用于產(chǎn)生參與病毒反防御的因子。許多CaMV宿主具有基于siRNA的病毒沉默機(jī)制，可用于限制病毒感染。上述600 bp序列的產(chǎn)物中，長度為21、22或24個核苷酸的病毒小RNA(vsRNA)用作誘餌、結(jié)合和滅活宿主沉默機(jī)制的效應(yīng)子，例如Argonaute 1(AGO1)。這些vsRNA的實(shí)驗(yàn)性過度表達(dá)允許增加受感染植物中的病毒積累。

關(guān)于在轉(zhuǎn)基因植物中使用CaMV 35S啟動子的擔(dān)憂

? ? ? ?最近，人們對使用CaMV 35S啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)提出了一些擔(dān)憂，因?yàn)樵搯幼雍蚉6的編碼序列之間存在序列重疊。 經(jīng)認(rèn)證在美國發(fā)布的54個轉(zhuǎn)基因事件包含高達(dá)528bp 的ORF VI(編碼P6的C端結(jié)構(gòu)域)。由于P6是一種多功能蛋白，其全部功能未知，因此有人擔(dān)心其一個或多個結(jié)構(gòu)域的表達(dá)可能會在轉(zhuǎn)基因生物中產(chǎn)生不可預(yù)見的后果。 最近的研究試圖確定什么長度的CaMV 35S啟動子最不可能無意中產(chǎn)生P6域，同時仍保持完整的啟動子活性。 正如人們所預(yù)料的那樣，使用較短的啟動子長度會減少包含的P6域的數(shù)量，也減少了產(chǎn)生不良影響的可能性。

總結(jié)

? ? ? ? 擬逆轉(zhuǎn)錄病毒分為兩類：肝DNA病毒(Hepadnavirus)與花椰菜病毒(Caulimovirus)。有極小的概率，擬逆轉(zhuǎn)錄病毒會逆轉(zhuǎn)錄出絲狀DNA/dlDNA，而不是開放環(huán)狀DNA/rcDNA，逆轉(zhuǎn)錄病毒會有極小的概率，逆轉(zhuǎn)錄出環(huán)狀DNA，泡沫病毒有20％概率包裝dsDNA片段。這充分證明，世界上所有的真核細(xì)胞、細(xì)菌、真菌、dsDNA病毒和ssDNA病毒很可能是由擬逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)化而來，而擬逆轉(zhuǎn)錄病毒很可能是由逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)化而來。

? ? ? ? 下期介紹的是單鏈DNA病毒。