Edman降解的化學原理

1. 偶聯(lián)：異硫氰酸苯酯（PITC）與蛋白質(zhì)/多肽的N端α殘基反應。

2. 環(huán)化裂解：苯氨基硫甲酰酞（PTC-肽）環(huán)化裂解

3. 轉(zhuǎn)化：噻唑呤酮苯胺（ATZ）轉(zhuǎn)化為苯異硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）

Edman測序儀的基本操作步驟

1. 首先打開高純氬氣閥使分壓為0.5mp，然后依次開泵，檢測器和測序儀主機開關(guān)，等待檢測器自動檢測完畢后，開計算機。

2. 打開計算機操作軟件到主菜單控制界面，按照操作指南準備測序前工作，如各種試劑和PTH-氨基酸配制裝載，HPLC系統(tǒng)洗脫液的準備等，注意每次測序前一定要仔細觀察每種試劑和洗脫液能夠保證此次測序能夠順利完成。

3. 樣品測序儀反應室前的預處理，首先在反應室上部玻璃塊加上新的玻璃纖維濾膜片，加Biobrene，干燥后上機進行預循環(huán)。在經(jīng)過預循環(huán)的玻璃纖維膜片上加入蛋白樣品，樣品干燥后，再在其上面覆蓋一微孔聚四氟乙烯（teflon）濾膜，將上下兩個玻璃柱體倒置后裝入反應夾套中固定。

4. 在計算機上編制本次測序的程序。如樣品名，選擇循環(huán)方法，設定循環(huán)數(shù)目，標準氨基酸和樣品進樣量等。

5. 將HPLC系統(tǒng)調(diào)整到優(yōu)化狀態(tài)，預先做一標準氨基酸循環(huán)，檢查所有PTH-氨基酸時候得到基線分離。

6. 測序完畢，關(guān)機。

7. 分析HPLC圖譜數(shù)據(jù)，與標準HPLC圖譜進行對比，從而對氨基酸進行鑒定。

Edman測序分析PTH-氨基酸的原理

總的來說，在每個測序循環(huán)中，首先先由Edman測序儀分離的PTH-氨基酸，接著使用HPLC分別測定PTH-氨基酸圖譜，再與20中氨基酸的標準HPLC圖譜，從而得到對應的氨基酸的信息。下圖中顯示了20個氨基酸的標準HPLC圖譜。

蛋白質(zhì)N端封閉案例

Edman降解法作為現(xiàn)有蛋白質(zhì)樣品N端序列測試的黃金標準，已得到廣泛應用。但是在實際應用中，Edman降解法也有一定的局限。例如，我們有一位客戶送來樣品，想要對一個的在芽孢桿菌中表達的重組蛋白的N端進行測序。然而我們將樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上之后測序過程中沒有任何信號，并且重復的依然如此，根據(jù)我們的經(jīng)驗我們推測重組表達蛋白可能發(fā)生了N-末端封閉。

那么什么是蛋白N端封閉呢？

蛋白質(zhì)的N端在未封閉的情況下具有自由的α氨基，PITC與α氨基反應是Edman降解測序反應的第一步。當?shù)鞍踪|(zhì)N端發(fā)生封閉時，N端的α氨基被修飾使得N端缺乏自由的α氨基，導致PITC實際無法與蛋白質(zhì)結(jié)合，使得Edman降解反應無法進行下去。其實在自然界中，50%的天然蛋白質(zhì)N端都經(jīng)過了修飾，常見的修飾包括乙?；?、甲基化、焦谷氨酸化等。另外，有時在蛋白樣品的分離提純過程中也有可能產(chǎn)生N端封閉修飾，這個主要是由于溶液中的去垢劑或化學物質(zhì)與蛋白樣品N端功能基團反應，或者分離提純使用的溶劑的pH值過高導致的。

由于目前Edman降解法用于蛋白質(zhì)N端封閉的情況是無法進行測序的。在這種情況下可以通過蛋白酶切成多肽片段再使用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法進行序列測定，如果造成蛋白質(zhì)N封閉的修飾是已知的，可以使用相對應的蛋白酶切除N端的修飾，接著就可以使用Edman降解反應進行測序。例如，許多抗體類藥物的N端存在焦谷氨酸環(huán)化封閉，當使用焦谷氨肽酶酶解后，就可以直接使用Edman降解法對抗體進行測序工作。

影響Edman降解結(jié)果的因素

1. 測序使用的化學試劑如果純度不夠高，也有可能在PTH色譜中產(chǎn)生假峰，從而影響對氨基酸序列的準確判定。

2. 由于各種氨基酸殘基化學或物理性質(zhì)不同，因此判斷其含量時PTH信號的強弱會發(fā)生變化。例如，酪氨酸和絲氨酸容易發(fā)生脫羥基造成峰值發(fā)生變化，當半胱氨酸發(fā)生修飾時很難檢測到信號，組氨酸和精氨酸由于極性難以被萃取，甲硫氨酸容易被氧化，這些因素都會導致峰值相應較低。

3. 帶有修飾殘基在檢測時表現(xiàn)出與其他未修飾氨基酸相似的峰也會造成氨基酸識別錯誤。