自噬干貨分享系列之經(jīng)典自噬研究
自噬最早于1962年由Ashford 和 Porter兩位學(xué)者提出，是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(autophagy related gene，Atg)的調(diào)控下利用溶酶體降解自身的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過(guò)程，是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象。
根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體途徑的不同，可將自噬分為大自噬、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（CMA）。由脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)包繞帶降解物形成自噬體，然后與溶酶體融合并降解其內(nèi)容物的過(guò)程稱為大自噬，即我們通常所說(shuō)經(jīng)典自噬。小自噬也發(fā)生相同的包繞過(guò)程，但包繞底物的是自身發(fā)生內(nèi)陷的溶酶體膜。CMA是指胞質(zhì)內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中并消化的過(guò)程，CMA在清除蛋白質(zhì)是有選擇性，底物為可溶的蛋白分子。
圖1 大自噬、小自噬、CMA圖解
細(xì)胞自噬參與調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)的合成、降解和重新利用之間的代謝平衡，對(duì)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝需要、更新某些細(xì)胞器并維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)有較重要的作用。由此可見，自噬處于一個(gè)穩(wěn)定的水平對(duì)我們的生命健康十分重要，越來(lái)越多的研究表明自噬失調(diào)可能與腫瘤、感染、神經(jīng)退行性變等疾病相關(guān)，因此對(duì)自噬的研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值。那么，如何研究自噬與疾病之間的關(guān)聯(lián)性，常用的研究思路是什么？需要用到哪些檢測(cè)自噬的工具？接下來(lái)，小編將一一介紹，在文章最后會(huì)分享兩個(gè)經(jīng)典自噬的研究案例幫助小伙伴們理解。在之后的自噬干貨分享系列中會(huì)針對(duì)如何研究其他自噬作詳細(xì)介紹，感興趣的童鞋可以關(guān)注后續(xù)的干貨分享哦。
01
自噬研究經(jīng)典思路
一個(gè)清晰的研究思路是做研究的第一步，也是非常關(guān)鍵的一環(huán)，明確研究思路之后設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案或是查找參考文獻(xiàn)才能事半功倍，自噬研究的常用思路可參考下圖。
圖2 自噬研究的思路
02
自噬研究常用工具
根據(jù)研究思路確定實(shí)驗(yàn)方案之后，自然是要選擇合適的研究工具。目前，檢測(cè)自噬水平的方法主要有三種：
（1）電鏡觀測(cè)自噬體的形成，該方法最為直接，但是僅能證明自噬的存在，難以反應(yīng)自噬活性的強(qiáng)弱。
（2）通過(guò)Western Blot檢測(cè)標(biāo)志物，如LC3/Atg8、p62/SQSTM1、Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1。這種方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，可以做到半定量檢測(cè)。
（3）檢測(cè)自噬流，即在熒光顯微鏡下采用GFP-RFP-LC3等融合蛋白來(lái)示蹤自噬體形成以及降解。這種檢測(cè)方法是使用GFP-RFP標(biāo)記及追蹤LC3，利用GFP（綠光）在酸性環(huán)境中淬滅的特性來(lái)觀察自噬，是目前自噬研究最常用的方法之一，其具體的作用原理可見圖3。
圖3 GFP-RFP-LC3作用原理圖
漢恒生物作為國(guó)內(nèi)首個(gè)研究自噬的公司，研發(fā)了多種自噬研究工具。mRFP-GFP-LC3是研究細(xì)胞自噬最常用的工具之一，在mRFP-GFP-LC3的基礎(chǔ)上漢恒生物研發(fā)出了AAV-LC3工具，可實(shí)現(xiàn)在體自噬監(jiān)測(cè)。后續(xù)還研發(fā)出了可定位細(xì)胞器的自噬研究工具，其原理是用細(xì)胞器-RFP（紅光）和LC3-GFP（綠光）分別標(biāo)記細(xì)胞器和自噬小體，實(shí)現(xiàn)兩者的共定位，例如線粒體定位的RFP（mito-RFP）、高爾基體定位的RFP（Golgi-RFP）、溶酶體定位的RFP（Lyso-RFP）等，具體可見表1。關(guān)于如何根據(jù)研究需求選擇并應(yīng)用這些工具，將會(huì)在之后的干貨分享中詳細(xì)介紹，感興趣的小伙伴可以留意一下哦。
表1 自噬研究工具
03
應(yīng)用案例
2018年江蘇大學(xué)張徐團(tuán)隊(duì)通過(guò)體外培養(yǎng)從人外周血分離的中性粒細(xì)胞，來(lái)研究胃癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體(GC-Ex)對(duì)中性粒細(xì)胞促腫瘤激活的影響。作者通過(guò)檢測(cè)中性粒細(xì)胞中的LC3發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在癌癥進(jìn)展中的促進(jìn)作用與自噬激活有關(guān)，接著作者使用自噬抑制劑處理中性粒細(xì)胞，觀察到中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞遷移明顯受到了抑制，表明中性粒細(xì)胞的自噬在胃癌進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。然后作者在自噬的不同階段使抑制或激活自噬，通過(guò)檢測(cè)LC3-II和ATG家族基因的表達(dá)水平，得出結(jié)論：GC-Ex通過(guò)HMGB1/TLR4相互作用激活NF-κB通路誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞自噬，激最終促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。這一研究結(jié)果為胃癌診斷、預(yù)后和治療提供了新的思路。
圖4 敲除HMGB1對(duì)中性粒細(xì)胞自噬的影響（檢測(cè)LC3、p65、ATG7等標(biāo)志物）
2022年，第四軍醫(yī)大學(xué)一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)TRPC1可能通過(guò)介導(dǎo)心肌凋亡和自噬參與心功能障礙是內(nèi)毒素血癥（ETM）誘導(dǎo)的心功能障礙的發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步闡明TRPC1的作用機(jī)制，研究人員使用攜帶CMV-mRFP-GFP-LC3的腺相關(guān)病毒（AAV9）（漢恒提供）對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行心肌內(nèi)注射以檢測(cè)自噬通量。研究結(jié)果表明TRPC1可促進(jìn)lps觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，介導(dǎo)小穴蛋白-1減少，進(jìn)而激活calpain調(diào)節(jié)心肌凋亡和自噬，從而導(dǎo)致ETM誘導(dǎo)的小鼠心功能障礙。
圖5 小鼠心臟在攻毒前4周轉(zhuǎn)染AAV9-mRFP-GFP-LC3熒光圖像
至此，本期內(nèi)容就結(jié)束了，主要介紹了自噬的概念，研究思路和工具并分享了兩個(gè)關(guān)于大自噬的研究案例，大家是否對(duì)自噬有了一個(gè)大致的了解呢，下期我們將繼續(xù)自噬干貨分享之內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬，我們下期見哦。
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