單細胞測序是指將新一代測序技術應用于單細胞，以表征其基因組、表觀基因組和轉錄組。在過去的幾年里，單細胞分析實際上徹底改變了我們研究復雜系統(tǒng)生物學的方法。事實上，標準的批量分析只能獲得許多細胞的生物學細節(jié)的平均圖像，因此失去了異質性信息。通過單細胞技術，我們可以揭示細胞之間的生物學差異，識別亞群以解開以前認為不變的組織中的多層異質性。通過這種方式，我們可以更好地了解單個細胞或一小部分細胞在其環(huán)境背景下的功能。

當然，這種分析需要大量的技術改進來克服處理如此少量的細胞和如此少量的基因組材料的限制。我們現(xiàn)在能夠使用非常有限數(shù)量的起始材料和細胞數(shù)量，據(jù)此我們可以根據(jù)樣品類型、系統(tǒng)復雜性和可用資源在不同平臺和實驗方法之間進行選擇。因此，一個非常重要的參數(shù)是我們需要的吞吐量。有兩種情況。我們可以處理低細胞數(shù)、低通量，例如在我們處理液體活檢、一般活檢或已分離的FACS分選細胞亞群的情況下。在這種情況下，我們將使用基于板的方法或集成流體回路。另一方面，我們還有另一種可能以高吞吐量工作。在這種情況下，微流體開始發(fā)揮作用。事實上，這種方法最近增加了單細胞分析的分析通量，一次對數(shù)千個細胞進行分析，不僅可以分析特定細胞類型，還可以分析整個組織。?

根據(jù)樣本類型和系統(tǒng)復雜性，我們需要定義要分析的細胞數(shù)量，以便定義合適的細胞捕獲平臺。事實上，必須考慮樣本的預期異質性和感興趣的亞群的估計豐度。需要高細胞數(shù)，例如數(shù)千個細胞，一百萬個細胞，在高度異質的樣品和稀有亞群的情況下，例如在腫瘤樣品或復雜組織的情況下，在這種情況下，我們應該選擇微流控平臺等高通量系統(tǒng)。相反，對于低復雜度的群體，我們還可以決定分析數(shù)百個細胞。

目前可用的技術是單細胞轉錄組學、基因組學和表觀基因組學。第一種情況，單細胞轉錄組學。如果您想描述復雜系統(tǒng)的細胞組成，我們可以通過scRNA測序確定獨特的分子譜。這是當今最常用的單細胞技術之一，也是因為它是所有單細胞方法中最穩(wěn)定的。這種方法已被用于描述許多復雜的系統(tǒng)，例如大腦。以前發(fā)布的大多數(shù)數(shù)據(jù)也可以通過2018年推出的單細胞表達圖譜來使用和詢問，該圖譜目前包括來自12個物種的123個單細胞RNA-Seq數(shù)據(jù)集.第二種情況是單細胞基因組學?；蚪M異質性是許多復雜疾?。ㄈ绨┌Y）的標志，其特點是細胞亞群進化出不同的基因型和表型。單細胞DNA測序成功地揭示了多種癌癥類型可以經(jīng)歷克隆進化，并識別與癌癥進展有關的創(chuàng)始人突變和亞克隆突變。根據(jù)先前的知識和我們的生物學假設，我們可以在單細胞水平檢測染色體拷貝數(shù)變異，成本可承受，但也可以使用全基因組單細胞測序或外顯子組測序檢測體細胞突變，但在這種情況下，與更高的測序成本和更高的分析相關復雜。第三種情況是表觀遺傳學。眾所周知，表觀基因組可塑性與許多生理過程有關，例如在癌癥中具有非常重要的作用。事實上，我們知道在腫瘤發(fā)生、轉移和耐藥性進化過程中，癌癥表觀基因組發(fā)生了顯著的重塑。由于靶向特定酶（如DNA甲基轉移酶和組蛋白脫乙酰酶）的治療藥物已被證明可有效治療多種癌癥類型，這表明表觀基因組改變在疾病進展中起關鍵作用。借助現(xiàn)在可用的單細胞技術，我們可以通過ATACseqDNA甲基化水平或組蛋白修飾轉錄因子與單芯片序列的結合來分析可接近的染色質。

讓我們從技術角度看一下單細胞實驗是如何進行的，基本上有五個步驟。當從復雜組織或液體組織（例如液體活檢）開始時，我們要做的第一件事是分解或分離要分析的感興趣的細胞，因為每個單細胞分析的起點都是獲得單細胞暫停。當然，我們要使用的具體方法取決于我們要處理的樣本類型，因此這取決于我們組織中細胞的豐富程度，我們是否要進行分析前富集，或者我們是否要保留空間信息。根據(jù)這些問題，我們將在顯微操作激光捕獲、酶解或機械解離之間進行選擇。在我們得到這個單細胞懸浮液后，我們需要將每個單細胞分隔成一個反應容器。根據(jù)吞吐量，該反應容器可以是微孔板的孔或進入微流體裝置的液滴。在這個微型反應容器中，所有的酶促反應都將發(fā)生。所以現(xiàn)在我們處于第三步，根據(jù)我們決定開始分析的特定組學，我們將繼續(xù)進行例如DNA擴增或RNA說明和逆轉錄，然后我們將開始準備真正的NGS測序文庫。然后這些樣本準備好進行測序和分析，當然，在最后一步中，測序數(shù)據(jù)將根據(jù)我們決定的應用程序進行特定的生物信息工作流程，例如轉錄組分析或基因組分析。

現(xiàn)在讓我們看看單細胞鉻RNA分析的具體方案是如何工作的。鉻方案的核心是將微流體與凝膠珠結合使用。凝膠珠在其表面涂有寡核苷酸，每個寡核苷酸由三部分組成。一個是特定的細胞條形碼，它對于每個珠子都是唯一的，并且在不同的珠子之間是不同的一個獨特的分子標識符，這將使我們能夠在文庫制備結束時分離和排除PCR重復，以及一個polyT故事以捕獲多腺苷酸化的RNA這種珠子與油和細胞一起進入微流體然后細胞在這些微滴內(nèi)與珠子一起被分隔，因為這些液滴內(nèi)還有裂解緩沖液，細胞立即被裂解，RNA被釋放并捕獲在上述珠子上，這樣每個細胞都是立即在轉錄組水平捕獲，并且它們的轉錄組沒有進一步的變化在收集完所有細胞數(shù)量之后，我們一開始就決定我們可以從適當?shù)奈膸熘苽涔ぷ髁鞒涕_始，這與標準批量處理非常相似。這是因為每個細胞在開始時都用細胞條形碼進行了標記，這樣我們可以在測序后在生物信息學水平上對包含該特定轉錄組的細胞信息進行反卷積所以在測序之后，我們最終會得到一組讀取開始使用細胞條形碼，然后是UMI和真實的轉錄信息，我們將使用細胞條形碼信息來折疊細胞類型的讀數(shù)，以便每個細胞都有其特定的轉錄組。然后我們將使用UMI信息來排除PCR重復，這樣我們就可以得到所謂的數(shù)字表達矩陣，在這個矩陣中，我們對每個特定細胞都有所有已識別基因的表達水平。數(shù)字表達式矩陣我們執(zhí)行一些QC和過濾。有了這些數(shù)據(jù)，我們使用聚類算法來產(chǎn)生某種可視化，例如tSNE或UMAP在這種圖表上，每個點代表一個細胞，并且在轉錄組水平上它們之間更相似的細胞聚集在一起所以在一個單個UMAP我們可以看到我們可以觀察到不同類型的群體這些群體的特征在于標記基因的特定子集。

現(xiàn)在讓我們回顧一下最廣泛使用的單細胞方法的一些實用建議，即單細胞RNA測序性能良好的scRNA-seq實驗保持原生表達配置文件。因此，必須小心處理樣品。每個組織都可能有特定的操作要求，在開始實際的單細胞實驗之前必須對其進行測試。理想情況下，樣品應在獲得后立即處理，并盡可能減少操作以避免細胞死亡，這可能導致一些亞群的損失和大量的環(huán)境RNA，這可能導致偽影。有許多可用的協(xié)議描述了穩(wěn)定和固定方法，例如基于使用DMSO或甲醇來克服這個問題。在scDNA或scATAC測序的情況下，起始材料是細胞核，因此在這種情況下，我們可以使用快速冷凍樣品。然而，這種技術存在一些挑戰(zhàn)，特別是，單細胞測序方法受到與所謂的丟失事件相關的高水平技術噪聲的影響，即由于固有缺乏起始材料而沒有觀察到或計數(shù)為零的基因和無法捕獲一些異常低豐度的轉錄本，這與我們在這種方法中使用的逆轉錄步驟效率低下和測序深度相對較淺有關?？偠灾瑔渭毎治鲱I域正在迅速發(fā)展，現(xiàn)在的方向是將空間成分整合到細胞組成的描述中，以便更系統(tǒng)地描述器官的復雜組織。此外，多組學分析也將成為未來幾年的關鍵詞。?