背景

控制基因組編輯的時(shí)間和空間對(duì)遺傳疾病的治療和研究遺傳變異具有巨大的潛力。盡管近年來(lái)CRISPR在治療領(lǐng)域的精確度、靶向范圍和適用性方面都取得了進(jìn)步，但在時(shí)間和空間上控制CRISPR編輯的工具仍然滯后。因Cas核酸內(nèi)切酶活性長(zhǎng)時(shí)間保持或不受限而導(dǎo)致的不受控CRISPR系統(tǒng)可能會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)測(cè)的脫靶效應(yīng)。為了解決這一問(wèn)題，人們提出了多種策略來(lái)操縱Cas蛋白的表達(dá)或其活性。在某些情況下，核酸內(nèi)切酶Cas9的產(chǎn)生可以由誘導(dǎo)物調(diào)控，還能以分裂或非激活的形式產(chǎn)生，之后可以通過(guò)小分子刺激或暴露于雙正交觸發(fā)器(如光)而被激活。而與優(yōu)化生產(chǎn)功能重組誘導(dǎo)Cas蛋白相比，gRNAs (crRNA或單gRNA)進(jìn)行修飾簡(jiǎn)單且成本低廉。

由于認(rèn)識(shí)到gRNA是CRISPR系統(tǒng)中最容易編程的組件，研究人員便著手研究那些可以很容易用最小的修飾進(jìn)行構(gòu)建的、能完全消除其招募到目標(biāo)基因組區(qū)域并在光下迅速激活的gRNA。這篇名為“Optical control of CRISPR-Cas editing with cyclically caged guide RNAs”的文章正是報(bào)道了來(lái)自北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心的Ying-Jie Sun等研究人員利用兩或三個(gè)預(yù)先安裝的光不穩(wěn)定取代基進(jìn)行簡(jiǎn)單的共價(jià)環(huán)化，最終成功通過(guò)光敏環(huán)狀gRNAs實(shí)現(xiàn)了由能從時(shí)空上調(diào)控的高效CRISPR/Cas9和cpf1所介導(dǎo)的基因編輯。在穩(wěn)定表達(dá)Cas9細(xì)胞中，環(huán)狀gRNA在光照射的協(xié)同作用下，可以在預(yù)先確定的切割區(qū)域內(nèi)精確切割GFP和VEGFA。另外研究人員還在胚胎中實(shí)現(xiàn)了光介導(dǎo)的MSTN基因編輯，而一種新的弓結(jié)型gRNA在沒(méi)有光照射的情況下沒(méi)有顯示出背景編輯。總而言之，該研究提供了一種能在時(shí)間與空間兩個(gè)維度精確操縱基因編輯的方法，較于傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9技術(shù)有了顯著的改進(jìn)。

首先，研究人員通過(guò)銅催化疊氮化物炔環(huán)加成反應(yīng)(CuAAC)使NPBOM結(jié)合寡核苷酸和不同的疊氮連接物制備了環(huán)狀gRNAs。與具有多個(gè)光不穩(wěn)基團(tuán)的線性gRNA相比，新型環(huán)狀gRNA缺乏靈活性。這幾種構(gòu)象的改變不僅破壞了堿基對(duì)與目標(biāo)DNA序列的相互作用，避免了任何部分的進(jìn)入，而且還抑制了誘導(dǎo)Cas的活性構(gòu)象進(jìn)行目標(biāo)DNA編輯。在光照射下，環(huán)狀gRNA會(huì)迅速釋放構(gòu)象應(yīng)變，使分子更接近其線性模擬物，從而恢復(fù)CRISPR/Cas編輯能力。因此，環(huán)形gRNA的光激活控制可以在最小的背景編輯下，以通用的方式快速、無(wú)創(chuàng)地激活CRISPR/Cas活性。

體外調(diào)控環(huán)狀crRNA的DNA切割/ CRISPR-Cpf1編輯

通過(guò)比較環(huán)狀GFP-crRNA-c2及其兩個(gè)線性前體的熔解特性(圖1A)發(fā)現(xiàn)，與線性crRNAs相比，前者因共價(jià)連鎖導(dǎo)致其熔點(diǎn)(Tm)顯著降低，說(shuō)明其無(wú)法與模板DNA結(jié)合，證明CRISPR-Cas9系統(tǒng)中的DNA干擾復(fù)合體由于環(huán)狀crRNA無(wú)法識(shí)別目標(biāo)位點(diǎn)或招募Cas9用于DNA切割而功能失調(diào)。另外，他們還發(fā)現(xiàn)crRNA-c對(duì)核酸內(nèi)切酶降解具有極端穩(wěn)定性，卻會(huì)在輻照度為20 mW·cm–2的365nm UV光照射下，在30秒內(nèi)釋放出線性crRNA(圖1C)，這為響應(yīng)性CRISPR編輯提供了一個(gè)極好的響應(yīng)窗口。通過(guò)更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這種技術(shù)應(yīng)用于CRISPR-Cpf1系統(tǒng)也是可行的，這意味著他們的光激活環(huán)狀gRNA策略是調(diào)控RNA-引導(dǎo)的CRISPR編輯的通用方法。

環(huán)狀crRNA在活細(xì)胞中光控CRISPR/Cas9編輯

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A是內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧和炎癥刺激下分泌的一種強(qiáng)效和特異性有絲分裂原。研究人員使用了這種光響應(yīng)CRISPR-Cas9編輯策略來(lái)破壞人類293T細(xì)胞中的VEGFA基因。制備對(duì)應(yīng)的NPBOM修飾VEGFA- crRNA -a和環(huán)狀產(chǎn)物VEGFA- crRNA-c(圖2B)，后者也表現(xiàn)出類似的光解離模式，在紫外線照射后不到1分鐘就釋放出線性的VEGFA- crRNA(圖2C)。為了驗(yàn)證在人類細(xì)胞中VEGFA基因被光響應(yīng)性破壞的可能性，他們隨后用未經(jīng)修飾的crRNA感染了組成型表達(dá)Cas9的293T-Cas9細(xì)胞（由源井生物提供），以靶向VEGFA。采用T7內(nèi)切酶I(T7E1)錯(cuò)配方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)帶有共價(jià)連接環(huán)的環(huán)狀crRNA-c在黑暗中顯示出9.6%的indel效率，而在紫外線照射5分鐘后的indel效率相當(dāng)（41.8%）。這一結(jié)果與使用天然crRNA進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)基本相同（53.9%）。綜上所述，所有這些結(jié)果都證明了利用環(huán)狀gRNAs實(shí)現(xiàn)光響應(yīng)基因編輯技術(shù)的可能性。

源井在該研究中提供了穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的293T-Cas9細(xì)胞，以驗(yàn)證光響應(yīng)環(huán)狀gRNA對(duì)293T細(xì)胞基因編輯的可能性。目前源井可提供多種Cas9細(xì)胞現(xiàn)貨助您進(jìn)行高效簡(jiǎn)便的基因編輯試驗(yàn)，除此之外KO細(xì)胞/野生型細(xì)胞/EGFP細(xì)胞系等均有現(xiàn)貨，現(xiàn)正火熱促銷，可復(fù)制鏈接了解詳情>>https://www.ubigene.com/ez_editor/?cate=1

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最后，研究人員還使用上述方法結(jié)合外部光刺激，實(shí)現(xiàn)了基于CRISPR/Cas技術(shù)的對(duì)小鼠受精卵中的MSTN基因編輯的時(shí)空控制。通過(guò)結(jié)合外部光刺激的方法，證實(shí)了該雙正交激活環(huán)狀gRNA可用于控制CRISPR系統(tǒng)。他們預(yù)測(cè)這些特征將被用于研究時(shí)空上復(fù)雜的生理事件，有助于更好地理解基因調(diào)控的動(dòng)態(tài)。

源井生物是一家專注于細(xì)胞基因編輯的企業(yè)，可在全球范圍內(nèi)提供優(yōu)質(zhì)的基因編輯細(xì)胞、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株、病毒包裝等相關(guān)服務(wù)，以及近3000種KO細(xì)胞現(xiàn)貨庫(kù)，基因敲除試劑盒等基因編輯相關(guān)產(chǎn)品，了解更多詳情歡迎咨詢我們！