編者按腫瘤分子分型：通過NGS、蛋白質(zhì)組等組學(xué)技術(shù)，對腫瘤進行分子譜的系統(tǒng)描繪，并根據(jù)分子特征譜，進行腫瘤的精準(zhǔn)分類及精準(zhǔn)診療研究。分子分型已成為國家精準(zhǔn)醫(yī)療戰(zhàn)略的重點研究投入方向；也備受CNS頂刊雜志青睞。為了幫助廣大臨床研究者了解腫瘤分子分型及診療研究的重大前沿進展，我們收集整理了近幾年來發(fā)表于Cell、Nature、Cancer Cell等頂刊上的，基于蛋白質(zhì)組及蛋白基因組的腫瘤分子分型相關(guān)研究論文。【腫瘤分子分型專輯】每周1篇，為大家精細(xì)解讀重磅研究與進展。

【文章題目】：Integrated Omics of Metastatic Colorectal Cancer

【癌種】：腸癌

【細(xì)分癌種】：早期非轉(zhuǎn)移性&轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（CRC）

【地域】：中國大陸

【通訊單位】：中科院上海生化細(xì)胞所

【發(fā)表時間】：2020年

【涉及組學(xué)】：全外顯子測序、DNA甲基化芯片、DIA蛋白組學(xué)、DIA磷酸化蛋白組學(xué)

【文獻出處】：

DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.08.002

主要成果

1.針對中國患者轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的大規(guī)模蛋白基因組學(xué)研究，繪制首個中國人結(jié)直腸癌多組學(xué)整合分子特征譜蛋白質(zhì)組學(xué)與磷酸化蛋白組學(xué)圖譜可成功識別腫瘤轉(zhuǎn)移并預(yù)測藥物反應(yīng)3.建立了完整的從多組學(xué)數(shù)據(jù)集生成到in vivo藥物敏感測試模型的分析流程4.改進對無可用藥物突變型患者的治療策略的選擇

疾病背景

【流行病學(xué)】：

結(jié)直腸癌(CRC)是全球第四大致命性癌癥，每年有近90萬人死亡。年齡、不良的飲食和生活方式都會增加結(jié)直腸癌的風(fēng)險。盡管治療手段不斷進步，但CRC，特別是轉(zhuǎn)移性CRC的死亡率在癌癥相關(guān)死亡中仍然很高。CRC表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性。

多組學(xué)特征預(yù)期有助于改善治療，從而導(dǎo)致精確和個性化的護理。已有的多組學(xué)研究更多地關(guān)注非亞洲人口中的非轉(zhuǎn)移性CRC，對于中國的患者的治療并不完全適用。

【主要驅(qū)動基因】：APC, TP53，KRAS

研究設(shè)計

【主要樣本】：早期-非轉(zhuǎn)移性CCRC、轉(zhuǎn)移性CCRC患者，經(jīng)手術(shù)切除的組織（原發(fā)癌組織（T），近端癌旁組織（P），遠(yuǎn)端正常組織（N））；及轉(zhuǎn)移性CCRC的遠(yuǎn)端肝轉(zhuǎn)移腫瘤組織（LM）

【樣本狀態(tài)】：新鮮冰凍

【樣本數(shù)量】：76對早期-非轉(zhuǎn)移CCRC、70對轉(zhuǎn)移性CCRC、43例遠(yuǎn)端肝轉(zhuǎn)移灶

【主要研究路線與內(nèi)容】：

1. 單組學(xué)分析：組別：原發(fā)灶癌組織（T） VS 遠(yuǎn)端正常組織（N）；

轉(zhuǎn)移灶癌組織（LM） VS 遠(yuǎn)端正常組織（N）等WES：基因拷貝數(shù)、基因突變；與TCGA隊列比較

DIA蛋白組 & MRM靶向蛋白組：蛋白鑒定與定量數(shù)量

DIA磷酸化蛋白組：修飾蛋白、修飾肽段鑒定與定量數(shù)量

2. 整合分析：

主要研究結(jié)果

一、多組學(xué)檢測結(jié)果的統(tǒng)計

二、原發(fā)灶-中國人群結(jié)直腸癌（CCRC）基因組情況

1. 對146例患者組織樣本進行基因組學(xué)檢測，最常見的突變基因為APC(65%)，TP53(64%)以及KRAS(32%)。

2. 中國人群特征：我國隊列CCRC數(shù)據(jù)，與TCGA以及MSK數(shù)據(jù)比較

（1）病理差異：三個隊列臨床病理特征存在明顯差異，且CCRC中直腸癌發(fā)病率更高，轉(zhuǎn)移性CRC（mCRC）的比例更高。

（2）基因突變差異：中國人群的CCRC特有突變特征，包括APC和TP53突變頻率略低，而PRRC2A、PPFIA4、CPD和NURP1L等突變頻率更高。

3.轉(zhuǎn)移性CRC特征：對中國人群中轉(zhuǎn)移性與非轉(zhuǎn)移性人群（mCCRC與non-mCCRC）進行了基因突變特征的對比：①mCCRC整體突變負(fù)擔(dān)更低；②SMAD4和XIRP2基因突變頻率升高；③多克隆結(jié)構(gòu)增多。

結(jié)論

鑒定了中國人群CCRC的主要基因突變；同時對比了mCCRC與non-mCCRC的基因突變特征，建立了完整的中國人群CCRC基因變異景觀。三、原發(fā)灶-蛋白質(zhì)組學(xué)揭示CCRC的獨特分子分型1.蛋白質(zhì)組分型：作者對146名CCRC患者原發(fā)腫瘤和遠(yuǎn)端正常組織進行DIA蛋白組學(xué)分析，通過共識聚類將其分成三個亞型（CC）：CCI型集中在RNA加工和DNA錯配修復(fù)（MMR）；CC2型集中在細(xì)胞外基質(zhì)-受體整合、粘著斑和免疫相關(guān)途徑；CC3型集中在DNA復(fù)制和代謝途徑激活。

2.亞型的臨床預(yù)后特征：三種亞型具有不同的無復(fù)發(fā)生存率，亞型是獨立預(yù)后因素。此外，對于轉(zhuǎn)移性患者，CC3型也較CC1/2型預(yù)后差。

3.亞型的分子表達特征：（1）CC3型：三個亞型之間的差異突變基因、SCNA以及差異蛋白有一定重疊，更多的突變顯著富集于CC3型；其中大多數(shù)SCNA在CC3亞型中出現(xiàn)更多的拷貝數(shù)刪除，并在蛋白水平上出現(xiàn)更高的表達。

（2）CC2型：DNA錯配修復(fù)（MMR）通路相關(guān)蛋白在CC2型中顯著下調(diào)。DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)其基因甲基化水平明顯與蛋白表達水平負(fù)相關(guān)。說明CC2型具有獨特的表觀遺傳特征。

4.與其他已報道分型的比較：將該蛋白質(zhì)組分型與CPTAC蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集以及CMS分類進行比對，發(fā)現(xiàn)分型結(jié)果總體上保持一致：CC1型與CPTAC亞型A和E相匹配，分別包含CMS1和CMS3，并且預(yù)后相對較好；CC2型，與C和CMS4亞型相似，預(yù)后比CC1型差；CC3型蛋白質(zhì)組對應(yīng)于CPTAC B型，以及多種類型的CMSs，體現(xiàn)了該亞型的復(fù)雜性。

結(jié)論

利用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)建立了CRCC三種分型，三種亞型具有不同的分子和預(yù)后特征，且與已有數(shù)據(jù)集的分型具有一致性。

四、原發(fā)灶—磷酸化蛋白質(zhì)組的CCRC分子分型：磷酸化蛋白組學(xué)可以區(qū)分mCCRC與non-mCCRC

1. 磷酸化蛋白組的分型：研究者對CCRC患者的原發(fā)腫瘤和遠(yuǎn)端正常組織進行DIA磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，從中發(fā)現(xiàn)了1487個差異磷酸化位點。進一步通過共識聚類，將其分為六個亞型。有趣的是，磷酸化蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)可將non-mCCRC與mCCRC進行分離（SC1、3、5型富含mCCRC患者；而SC2、4、6型富含non-mCRC患者），但基于蛋白組學(xué)的三種亞型中mCRC與non-mCRC沒有顯示出明顯的區(qū)分。

2.磷酸化蛋白亞型的分子功能特征：對差異磷酸化的蛋白質(zhì)進行了功能富集分析，發(fā)現(xiàn)在SC1，SC3和SC5中高表達的磷酸化蛋白在粘著斑和粘附連接途徑中富集；在SC2，SC4和SC6中上調(diào)的磷酸位點則在ERBB2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、子宮內(nèi)膜癌、抗原加工和呈遞及FcγR介導(dǎo)的吞噬途徑中富集，這些上調(diào)的磷酸化蛋白在亞型間的特性不強。

3.磷酸化蛋白亞型的激酶-底物關(guān)聯(lián)特征：激酶底物關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，SC1，SC3和SC5中的激酶與磷酸酶之間大多呈負(fù)相關(guān)，而SC2和SC4中的正相關(guān)則呈正相關(guān)。比較特殊的是SC6，其特征為激酶與底物之間呈負(fù)調(diào)控，這表明CC3中的non-mCRC更像是mCRC，且具有較差的預(yù)后。

結(jié)論

磷酸化蛋白組學(xué)可以更細(xì)分mCRC與non-mCRC，對蛋白質(zhì)組學(xué)分析做有效補充。此外，不同的亞型具有不同的磷酸化-底物關(guān)聯(lián)特征，并且可能與預(yù)后有關(guān)。

五、轉(zhuǎn)移灶—轉(zhuǎn)移性CCRC的蛋白基因組分析

基因組水平：原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶在基因水平上整體具有高度一致性，包括驅(qū)動基因突變及SCNA。與原發(fā)灶相比，轉(zhuǎn)移灶的單克隆比例更高。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)移灶源自原發(fā)灶或相同的祖先克隆。

2.蛋白組水平：轉(zhuǎn)移灶的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示與原發(fā)灶明顯不同。與原發(fā)灶相比，轉(zhuǎn)移灶比正常組織表現(xiàn)出更多的蛋白表達上調(diào)，這些差異表達的蛋白質(zhì)清楚地將轉(zhuǎn)移組織與原發(fā)組織區(qū)分開：1）轉(zhuǎn)移灶中上調(diào)蛋白主要集中在ECM-受體互作、藥物代謝、細(xì)胞粘附和緊密連接相關(guān)；2）轉(zhuǎn)移灶中下調(diào)蛋白集中在代謝途徑、脂肪酸降解、TCA循環(huán)和氧化磷酸化中。

結(jié)論轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶的蛋白基因組學(xué)對比，顯示二者基因組學(xué)上的同源性與蛋白組水平上的異質(zhì)性；相比于基因足，蛋白質(zhì)表達差異可以有效地對轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶進行區(qū)分。六、轉(zhuǎn)移性CCRC的磷酸修飾位點與蛋白的表達協(xié)變特征1.?磷酸化位點與蛋白的表達相關(guān)性：研究者分析了42例mCRC患者（10例CC1型，21例CC2型，11例CC3型）的所有四種組織類型（N，P，T和LM）。研究者針對每一例mCRC，計算了所有4個組織中每兩個匹配的磷酸化位點豐度和蛋白質(zhì)豐度之間的相關(guān)系數(shù)。為進一步尋找三種CC亞型的磷酸化位點-蛋白共調(diào)控關(guān)系，研究者利用ANOVA鑒定出了在三種亞型中存在顯著差異的954種磷酸化-蛋白關(guān)系對（CC2表現(xiàn)出明顯的負(fù)向調(diào)控、CC1和3表現(xiàn)出更多的正相關(guān)）。

2.磷酸化位點-蛋白對的分類及特征：（1）這954個磷酸化-蛋白關(guān)系對可將三個亞型進行有效區(qū)分，并且可被分為三個cluster：CC1neg、CC2neg和CC3neg。CC3neg富集于平滑肌收縮、傷口響應(yīng)等功能；CC1neg于LIS1途徑、內(nèi)吞作用、P75 NTR受體信號等；CC1neg顯著參與mRNA代謝過程、核糖核蛋白復(fù)合生物發(fā)生等。（2）利用激酶底物注釋，進一步發(fā)現(xiàn)CC3neg具有最多的激酶富集，且3種cluster無共有上游激酶。對應(yīng)于10激酶的14個磷酸化位點存在顯著的共同調(diào)節(jié)。

（3）研究者利用MCODE復(fù)合/子網(wǎng)絡(luò)分析方法，發(fā)現(xiàn)了五個核心網(wǎng)絡(luò)，包含了112個節(jié)點和355個連接，并對CC1neg、CC2neg和CC3neg中的特異的核心網(wǎng)絡(luò)進行了展示。其中TP53和LKB1通路是CC1neg和CC3neg的top MCODE；而mRNA 剪切體復(fù)合物是CC2neg的top。

結(jié)論

磷酸化位點-蛋白的相關(guān)性分析顯示，即使是同一個病人，其不同的組織（N，P，T和LM）中存在的磷酸化-蛋白的關(guān)聯(lián)具有不同的特征，且與亞型相關(guān)。

七、轉(zhuǎn)移性CCRC的潛在藥物靶點：激酶與底物分析

1. 亞型的激酶活性特征：作者對每種CC亞型的mCRC原發(fā)和轉(zhuǎn)移組織中差異豐富的磷酸化位點進行分析，并推斷出相應(yīng)激酶的活性。作者發(fā)現(xiàn)不同的CC亞型富含不同激酶。且同一亞型的原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶中，同一激酶也會表現(xiàn)出不同活性。例如CDK5僅在CC1型的原發(fā)灶表現(xiàn)出高活性；MAPK1在CC3型的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶均具有高活性，但在其他亞型中無此活性。

2.亞型的激酶-磷酸化底物表達與網(wǎng)絡(luò)特征：進一步同時考慮蛋白表達水平的變化。作者發(fā)現(xiàn)激酶及底物的表達在不同亞型中也同樣具有高度異質(zhì)性。進一步基于蛋白-底物相關(guān)系數(shù)，構(gòu)建不同亞型原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶的共表達網(wǎng)絡(luò)。同樣的，蛋白-底物網(wǎng)絡(luò)也呈現(xiàn)出不同亞型及不同組織間的特異性差異；并且同一亞型的原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間的差異，大于各亞型的原發(fā)灶之間的差異。

結(jié)論

通過分析不同亞型中的激酶表達與活性，揭示了潛在的藥物治療靶點。但無論是激酶活性，還是激酶-底物表達網(wǎng)絡(luò)，均呈現(xiàn)出原發(fā)與轉(zhuǎn)移灶間的高度異質(zhì)性，提示即使是同一病人，其不同組織對藥物的敏感性也可能會不同。

八、用判別模型指導(dǎo)藥物選擇

1.三種激酶抑制劑的PDX模型治療響應(yīng)測試：為進一步探索mCCRC患者藥物反應(yīng)潛力，研究者對31種miniPDX模型中的三種激酶抑制劑（阿法替尼、吉非替尼和雷戈非尼）進行藥理測試，其中包括9對原發(fā)性轉(zhuǎn)移腫瘤和13種原發(fā)腫瘤。研究者通過腫瘤生長抑制來評估不同藥物效果，并進一步確定同一人的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶對同一藥物表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。此外，值得注意的是，CCRC-0323 組織具有regorafenib的高響應(yīng)，與其具有RAF1基因突變一致；但雖然其同樣存在ERBB2基因突變，但卻對ERBB2抑制劑afatinib無響應(yīng)。而CCRC-0397組織，沒有RAF1突變，卻對上述兩種抑制劑均有良好的響應(yīng)。此結(jié)果表明，磷酸化蛋白組對藥物選擇的指示比基因突變信息更敏感。

2.藥物治療響應(yīng)預(yù)測模型：研究者建立了基于1696個邊緣強度特征的彈性回歸模型，用于預(yù)測藥物反應(yīng)。該模型對上述抑制劑響應(yīng)的預(yù)測結(jié)果，與實際結(jié)果具有高度一致性，證實激酶-磷酸底物網(wǎng)絡(luò)在預(yù)測mCCRC患者藥物敏感性方面具有強大潛力。此外，作者發(fā)現(xiàn)EFGR與PTPN1-Y8的正相關(guān)性，以及EFGR與IRS1-S3的負(fù)相關(guān)性，均對afatinib的響應(yīng)有貢獻，說明藥物響應(yīng)并不是單因素決定的，而需要多個分子信息協(xié)同指征。

結(jié)論：

進一步證實了同一病人的不同組織對藥物的敏感性會有所不同?；诩っ?底物表達網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建了能夠有效預(yù)測藥物治療響應(yīng)的模型。同時，進一步強調(diào)了蛋白水平、磷酸化水平，以及多分子水平對藥物選擇的必要意義。

總結(jié)

該研究系統(tǒng)性分析了146例中國人群隊列的結(jié)直腸癌患者組織的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，包括其中的70例轉(zhuǎn)移性患者。蛋白質(zhì)組學(xué)區(qū)分了三種CCRC亞型，各亞型具有不同的臨床預(yù)后和分子特征；磷酸化蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)有助于進一步區(qū)分轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移患者。原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶表現(xiàn)出基因水平的高度相似性，但在蛋白組水平上存在顯著差異。該研究進一步構(gòu)建了激酶-底物網(wǎng)絡(luò)模型進行藥物響應(yīng)的預(yù)測，并進行了PDX模型的藥效學(xué)測試驗證。藥效測試結(jié)果進一步發(fā)現(xiàn)：即使同一患者，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶對同一藥物也表現(xiàn)在不同的藥物敏感性；激酶-底物對藥物敏感性的預(yù)測，比藥靶基因信息更加敏感和有效。綜上所述，該研究為中國人CRC研究提供了有價值的數(shù)據(jù)資源，有利于更好地理解轉(zhuǎn)移性CRC，并提供了臨床應(yīng)用的潛力。