前言

進行蛋白質(zhì)互作分析時你是否也遇到這樣的問題：

1. 基于生物物理方法進行互作親和力檢測一般需要高質(zhì)量和純度的蛋白。因此，必須建立合適的純化體系，然而一些蛋白本身很難純化，如膜蛋白。

2.?親和力檢測通常在人工緩沖系統(tǒng)中進行，與存在天然配體、底物和離子的體內(nèi)情況相比，這可能極大地影響結合研究的結果。

使用MST技術進行互作親和力檢測可以解決以上問題！既然難純化，使用MST技術可以免純化?。?！想要模擬體內(nèi)環(huán)境，那就在裂解液環(huán)境下甚至用全細胞進行親和力檢測！

下邊跟著小編來看兩個MST免純化互作檢測的案例吧！

MST應用案例一

在裂解液中檢測膜蛋白與小分子互作

抗抑郁藥物（AD）結合到靶點上進而產(chǎn)生臨床抗抑郁效果的機制尚不清晰。赫爾辛基大學研究人員發(fā)現(xiàn)腦膽固醇（CHOL）可直接與神經(jīng)營養(yǎng)酪氨酸激酶受體2 (TRKB) 跨膜域(TMD)結合，進而調(diào)節(jié)TRKB信號通路。此外，發(fā)現(xiàn)典型和快速作用的抗抑郁藥直接結合到TRKB TMD二聚體形成的一個位點上，從而促進TRKB細胞表面表達，增強腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）信號傳導。該研究解決了關于抗抑郁藥臨床療效的基礎分子機制問題。

在此研究中，作者使用MST技術檢測TRKB與CHOL和ADs的結合。TRKB為跨膜蛋白，且分子量較大92kD，很難純化。作者將GFP-TRKB質(zhì)粒轉染至HEK293T中過表達。進行互作親和力檢測時，直接將過表達GFP-TRKB的HEK293T細胞裂解后取上清。以GFP-TRKB融合蛋白作為熒光信號源，進行MST檢測。

向HEK293T細胞裂解液中加入梯度稀釋的CHOL，通過MST技術檢測到CHOL與GFP-TRKB的親和力為~20μM。表明CHOL可直接與TRKB結合，突變TRKB 433位關鍵氨基酸破壞了TRKB與CHOL之間的相互作用。

抗抑郁藥結合TRKB跨膜結構域
MST結果顯示了抗抑郁藥氟西汀（FLX）和GFP標記的TRKB在HEK293T細胞裂解液中的直接相互作用。

MST應用案例二

完整細胞與蛋白間的親和力檢測

如果研究對象是完整的細胞、細菌或者病毒，MST技術仍然可以應對。[1][2]

血小板膜含有多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)往往連接大量的糖鏈而成為糖蛋白。(GP) Ib-IX-V復合物是血小板主要糖蛋白之一，維持血小板結構的完整性，具有凝血酶受體功能。(GP) Ib-IX-V是異質(zhì)多聚體，其中GP Ib由CD42b、CD42c以二硫鍵相連而成。CD42b為跨膜蛋白，其含糖量占總分子量的60%。使用MST實現(xiàn)了完整血小板表面上的CD42b與其抗體之間的親和力檢測[1]。

從新鮮的血液中分離完整血小板，計數(shù)后通過公式計算GP Ibα的摩爾濃度。

進行MST實驗時，使用藻紅蛋白（RPE）標記CD42b抗體作為熒光信號源，加入梯度稀釋的血小板，室溫孵育5min后檢測得到CD42b抗體與完整血小板表面上的CD42b之間的親和力為14nM, RPE 標記的單克隆亞型作為陰性對照。

MST技術對測定緩沖液沒有限制，適用于分析未純化的蛋白質(zhì)，甚至全細胞的親和力檢測，有助于我們更好地理解體內(nèi)大分子擁擠環(huán)境中的真實互作情況，節(jié)省時間和成本。

參考資料：

1.MO-P-051 | Anti-CD42b – CD42b (on intact platelets)

2.MO-P-046 | Influenza Virus X31 – Inhibitor Coated Nanoparticle