單細(xì)胞測序技術(shù)，既往從未有過接觸，也沒有自學(xué)資料的整理，今天以單細(xì)胞測學(xué)技術(shù)在非小細(xì)胞肺癌領(lǐng)域的應(yīng)用探索綜述進(jìn)行知識盲區(qū)的掃盲。

——單細(xì)胞測序技術(shù)——

單細(xì)胞測序是從單個細(xì)胞水平對基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究。2015 年以來，10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq?等技術(shù)的出現(xiàn)，徹底降低了單細(xì)胞測序的成本門檻。自此，單細(xì)胞測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科研和臨床研究。通過單細(xì)胞測序可以最大程度的反映細(xì)胞的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞群和細(xì)胞亞群，并為闡明細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)控機(jī)理提供了技術(shù)保障。單細(xì)胞技術(shù)以及數(shù)據(jù)分析方法在腫瘤、發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域有重要應(yīng)用，是現(xiàn)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。

首先需要明確的一點(diǎn)：單細(xì)胞測序首先不是僅僅對一個細(xì)胞進(jìn)行測序，而是說該項技術(shù)能對單一細(xì)胞的基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，可以理解為單細(xì)胞水平上的測序。本文主要探索單細(xì)胞測序技術(shù)在腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用，因此，主要聚焦腫瘤相關(guān)的技術(shù)研發(fā)進(jìn)展。

腫瘤相關(guān)細(xì)胞異質(zhì)性測序困境

• 比如，在腫瘤組織中，腫塊中心的細(xì)胞與腫塊周圍的細(xì)胞，原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞，其基因組與轉(zhuǎn)錄組等遺傳信息是存在差異的，這也就導(dǎo)致不同腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出免疫特性、生長速度、侵襲能力等表型方面的差異，最終導(dǎo)致對不同抗腫瘤藥物的敏感性不同或放療敏感性的差異。

• 傳統(tǒng)測序方法所展示的信息是在多細(xì)胞水平上的平均信息，異質(zhì)性信息容易被忽略掉，而單細(xì)胞水平上的測序則完全可以反應(yīng)同一個細(xì)胞群里不同細(xì)胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組狀況。單細(xì)胞測序技術(shù)的出現(xiàn)，使得從混雜的樣品中篩選出異質(zhì)性信息的難題得以解決。

• 單細(xì)胞測序技術(shù)以單個細(xì)胞作為對象，通過對單個細(xì)胞遺傳物質(zhì)均勻擴(kuò)增，標(biāo)記建庫后進(jìn)行測序，最后對單個細(xì)胞基因組或轉(zhuǎn)錄組展開數(shù)據(jù)分析，其技術(shù)原理主要包括單細(xì)胞分離、擴(kuò)增測序和數(shù)據(jù)分析3方面。最為核心的，或者我認(rèn)為大家需要記住的流程，主要是：分離單細(xì)胞（核），將RNA轉(zhuǎn)換為cDNA，準(zhǔn)備測序文庫（illumina）后測序。
  

這里就用到我之前整理的幻燈（藥物研發(fā)基本原理（第二章）(下)）也是本文持續(xù)回顧基礎(chǔ)，同時追蹤前沿進(jìn)展兩步走的重要原因所在。離開了基礎(chǔ)太遠(yuǎn)的設(shè)想，都是無根之萍。

對于具體的單細(xì)胞測序技術(shù)不同類型的比較和詳細(xì)的流程，不在此次介紹范疇，也超脫了目前的能力范疇。以上知識點(diǎn)能掌握即可。

——NSCLC的單細(xì)胞測序技術(shù)綜述——

摘要

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的一線免疫治療大大提高了患者的生存率。在免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用之前，患者需要進(jìn)行PD-L1檢測。然而，PD-L1生物標(biāo)志物無法準(zhǔn)確預(yù)測患者的免疫治療反應(yīng)。另一方面，免疫療法所導(dǎo)致的免疫相關(guān)毒性機(jī)制尚不清楚。因此，開發(fā)臨床認(rèn)可的預(yù)測性生物標(biāo)志物以更好地選擇免疫治療獲益型患者并改善風(fēng)險管理的需求，是目前臨床尚未滿足的需求。單細(xì)胞技術(shù)為腫瘤及其微環(huán)境提供了前所未有的洞察力，從而發(fā)現(xiàn)了參與免疫檢查點(diǎn)抑制劑反應(yīng)或毒性的免疫細(xì)胞。在這篇綜述中，研究團(tuán)隊將強(qiáng)調(diào)單細(xì)胞方法識別候選生物標(biāo)志物以改善NSCLC患者治療的潛力。

晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的生物標(biāo)記物鑒定

PD-L1免疫組化用于測定PD-L1表達(dá)腫瘤細(xì)胞的比例, 探尋免疫治療效果與PD-L1免疫組化的相關(guān)性，是第一個發(fā)表的ICI治療相關(guān)的生物標(biāo)志物。多個前瞻性試驗表明，組織PD-L1表達(dá)水平與臨床療效之間存在相關(guān)性，特別是KEYNOTE-001，KEYNOTE 024和PACIFIC研究。

不同的ICI采用不同的PD-L1檢測技術(shù)平臺：帕博利珠單抗為22C3，納武利尤單抗為28–8，另外，納武利尤單抗為SP263，阿替利珠單抗為SP142。22C3、28–8和SP263測定結(jié)果相似，但SP142靈敏度降低。

然而，IHC染色（腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞或兩者）的最佳選擇和PD-L1染色陽性的cut-off值仍在爭論中。此外，一些研究表明PD-L1表達(dá)不能預(yù)測ICI治療的臨床效果，一些患者的PD-L1表達(dá)<1%卻具有顯著的應(yīng)答率。由于這些原因，PD-L1表達(dá)被認(rèn)為是不完美的生物標(biāo)志物。

表1. 使用單細(xì)胞技術(shù)鑒定NSCLC免疫治療預(yù)測性生物標(biāo)志物的綜述

Datar等人對20例原發(fā)性切除NSCLC的浸潤白細(xì)胞進(jìn)行表型分析，以評估三個免疫檢查點(diǎn)PD-1、LAG-3和TIM-3表達(dá)的生物學(xué)意義。通過包含35個標(biāo)記的panel能夠監(jiān)測9種不同的免疫人群：CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）、自然殺傷（NK）細(xì)胞、NKT細(xì)胞、B細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。

• PD-1主要表達(dá)于CD8+T細(xì)胞，CD25?FOXP3?CD4+T輔助細(xì)胞， CD3+CD56+ NKT細(xì)胞；

• TIM-3在巨噬細(xì)胞中廣泛表達(dá)，NK和NKT細(xì)胞表達(dá)最高；

• 關(guān)于它們的共表達(dá)比例，5.4%的CD3+TIL對三種標(biāo)記物呈陽性，9.1%為PD-1+LAG-3+，21%為PD-1+TIM-3+，10.3%為LAG-3+TIM-3+。有意思的是，PD-1和TIM-3的共表達(dá)有利于耗盡T細(xì)胞的持續(xù)存在。

由于該panel包含提示細(xì)胞功能的標(biāo)記，研究者研究了表達(dá)上述免疫檢查點(diǎn)的T細(xì)胞的功能特征。并評估了三個免疫檢查點(diǎn)對90名接受PD-1抑制劑治療的患者生存率的影響。

• PD-1+LAG-3+TIM-3+T細(xì)胞的活化標(biāo)志物CD69和4-1BB、細(xì)胞毒性標(biāo)志物顆粒酶GZMB、增殖標(biāo)志物Ki67、凋亡受體FAS和促凋亡蛋白BIM的表達(dá)最高。

最后，他們評估了三個免疫檢查點(diǎn)對90名接受PD-1抑制劑治療的患者生存率的影響。

• PD-1和TIM-3 T細(xì)胞的高表達(dá)都不能預(yù)測PFS的改善；

• 然而，LAG-3表達(dá)高的患者表現(xiàn)出明顯較差的預(yù)后，而LAG-3低表達(dá)和PD-L1高表達(dá)的患者具有改善的PFS；

• 這些結(jié)果表明，LAG-3可能是免疫療法耐藥性的重要靶點(diǎn)，并可作為改善ICI反應(yīng)的靶點(diǎn)。

延申閱讀：

• 2022年3月19日，百時美施貴寶（Bristol Myers Squibb, BMS）宣布其First-in-class雙免疫療法Relatlimab+Nivolumab固定劑量組合Opdualag獲FDA加速批準(zhǔn)上市，治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。Relatlimab是一款靶向淋巴細(xì)胞活化基因3（LAG3，CD223）的單抗藥物）；

• 2022年10月5日，Immutep公司宣布，美國FDA已授予其潛在“first-in-class”可溶性LAG-3融合蛋白eftilagimod alpha（efti，又名IMP321）快速通道資格，與抗PD-1抗體Keytruda聯(lián)用，一線治療非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。

irAE

ICI的臨床益處受到irAE的限制。約10%的NSCLC患者在免疫治療過程中會發(fā)生3級及以上irAE，導(dǎo)致ICI暫?；蛴谰猛Ｓ谩?/p>

與單獨(dú)使用PD-1/PD-L1抑制劑相比，化療聯(lián)合PD-1/PD-L2抑制劑與較低的嚴(yán)重irAE風(fēng)險相關(guān)，CTLA-4抑制劑的加入，增加了患者3級及以上irAE的發(fā)生率。

盡管irAE的發(fā)展與PD-1/PD-L1抑制劑的療效改善相關(guān)，ICI相關(guān)的肺炎和任何級別的心肌炎都與NSCLC患者的生存率降低有關(guān)。

IrAEs治療主要依賴皮質(zhì)類固醇，根據(jù)嚴(yán)重程度從低劑量到高劑量。

一項對2750名接受ICI治療的肺癌患者進(jìn)行的研究表明，在2%的嚴(yán)重irAE患者中，43%的患者出現(xiàn)了抗類固醇的irAE。

因此，這些高度異質(zhì)性毒性的病理生理學(xué)需要進(jìn)一步研究，以指導(dǎo)患者的風(fēng)險分層和管理策略，并擴(kuò)大ICI的臨床益處。

表2. 使用單細(xì)胞技術(shù)研究ICI誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌irAE的綜述

盡管ICI相關(guān)irAE的病理生理學(xué)與新發(fā)自身免疫性疾病相似，但其確切的潛在機(jī)制尚未完全闡明。近年來，采用單細(xì)胞測序技術(shù)用來探尋相關(guān)標(biāo)記物與irAE發(fā)生機(jī)制和幾率關(guān)系的研究逐漸增多。

對于單細(xì)胞測序技術(shù)的基礎(chǔ)研究，不是本文的重點(diǎn)，對于資本過度介入的領(lǐng)域，特別是新興行業(yè)，一直保持謹(jǐn)慎的態(tài)度。也為了防止造成臨床指導(dǎo)用藥的誤導(dǎo)，對于具體的偏重基礎(chǔ)研究的內(nèi)容不再翻譯。上述療效中有關(guān)LAG3的延伸閱讀，也是基于真實世界中已經(jīng)獲得驗證的實例進(jìn)行佐證。本文重點(diǎn)還是就單細(xì)胞測序技術(shù)進(jìn)行自我知識盲區(qū)的掃盲工作，僅此而已。

參考文獻(xiàn)

Wlosik J, Fattori S, Rochigneux P, Goncalves A, Olive D, Chretien AS. Immune biology of NSCLC revealed by single-cell technologies: implications for the development of biomarkers in patients treated with immunotherapy. Semin Immunopathol. 2022 Nov 21. doi: 10.1007/s00281-022-00973-1. Epub ahead of print. PMID: 36414693.