本期特邀文章第一作者伍紫娟博士分享解讀，感謝對circRNA平臺的關(guān)注！

慢淋（CLL,chronic lymphocytic leukemia）是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，具有高度的代謝異質(zhì)性。雖然已經(jīng)有報道表明m6A能通過調(diào)控環(huán)狀RNA分子參與代謝通路，但該過程在CLL仍有待進一步研究。

2023年10月11日，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院李建勇/范磊/金暉教授團隊在ADVANCED SCIENCE(IF:15.1)發(fā)表了的研究論文“m6A-Modified circTET2 Interacting with HNRNPC Regulates Fatty Acid Oxidation to Promote the Proliferation of Chronic Lymphocytic Leukemia”。

文章第一作者為南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科伍紫娟博士，部分生物信息學(xué)分析和生物實驗由吉賽生物提供支持。

文章要點

• 根據(jù)53例CLL轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及臨床信息搭建 m6A scoring system，并構(gòu)建了m6A相關(guān)的 circRNA預(yù)后Signature；

• CLL患者中高表達circTET2預(yù)后差；核質(zhì)轉(zhuǎn)運受到m6A水平影響；circTET2生物合成受RNA 結(jié)合蛋白（RBP）RBMX和YTHDC1調(diào)控；

• circTET2通過結(jié)合HNRNPC蛋白質(zhì)調(diào)控CPT1A mRNA的穩(wěn)定性，并且參與CLL細胞的脂肪酸氧化（FAO,fatty acid oxidation）和mTORC1通路介導(dǎo)的細胞增殖過程；

• circTET2臨床轉(zhuǎn)化相關(guān)探索中，該環(huán)狀RNA豐度受到剪切體抑制劑CP028影響，其聯(lián)合mTOR抑制劑Dactolisib和FAO抑制劑Perhexiline具有協(xié)同殺傷CLL細胞的效果。

該課題同期在美國舉行的第20屆國際慢性淋巴細胞白血病研討會（iwCLL）上由金暉教授進行口頭匯報，并獲得各專家一致認可。南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院李建勇/范磊/金暉教授團隊主要研究方向為淋巴增殖性疾病，包括慢性淋巴細胞白血病診斷、鑒別診斷、預(yù)后相關(guān)因素、發(fā)病機制及臨床治療研究。擅長利用多參數(shù)流式細胞術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)對惡性血液病診斷分型、預(yù)后判斷、病情監(jiān)測，并根據(jù)患者的臨床生物學(xué)特征采取個體化治療策略，處于國際領(lǐng)先水平。

以下是文章內(nèi)容的詳細解讀

1、CLL中m6A修飾相關(guān)基因臨床意義；根據(jù)m6A修飾相關(guān)circRNA構(gòu)建風(fēng)險模型

為了確定m6A修飾在CLL中的意義，作者對53名初診CLL患者進行了全轉(zhuǎn)錄組測序。

作者首先分析了34個m6A writer、reader和eraser調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄組圖譜，包括m6A調(diào)節(jié)因子的表達模式及對應(yīng)關(guān)系（圖1A~B）。后續(xù)基于m6A調(diào)控子的表達以及臨床特征，作者構(gòu)建了m6Sig評分（圖1C）。m6Sig評分顯示出其對預(yù)后的潛在預(yù)測價值，m6Sig評分低的患者具有顯著較好的生存預(yù)后（圖1D）；公共CLL數(shù)據(jù)集GSE22762亦得到一致結(jié)果（圖1E）。作者進一步利用m6A相關(guān)circRNA構(gòu)建風(fēng)險模型，篩選相關(guān)系數(shù)大于0.5的circRNAs（圖1F，G）。CLL患者根據(jù)風(fēng)險評分被分為低風(fēng)險組和高風(fēng)險組。最終選擇了八個與m6緊密相關(guān)的circRNAs（circTET2、circUBE2I、circPRDM2、circMGA、circUSP34、circSIN3A、circSLC39A10和circFTO）（圖1H）。我們注意到，與低風(fēng)險組相比，高風(fēng)險組的患者OS更短（圖1I），CLL患者的風(fēng)險評分也顯示出較高的AUC值（圖1J）。

2、m6A修飾的circTET2與CLL患者預(yù)后相關(guān)

circTET2的風(fēng)險評分在模型中排名第一。CircBank數(shù)據(jù)庫顯示，circTET2、circPRDM2和circSLC39A10表現(xiàn)出更高的m6A水平（圖2A）。利用MeRIP-seq來探索CLL細胞系中m6A的修飾情況。一部分m6A 峰分布在編碼序列（CDS）、3′非翻譯區(qū)（UTR）、5′UTR和ncRNA外顯子（圖2B）。AAAC被檢測為細胞中的主要motif（圖2C）和m6A峰富集在CDS，尤其是在起始密碼子附近（圖2D）。circTET2和circPRDM2的m6A峰在m6A組中比在IgG組中更豐富（圖2E）。因此，作者選擇了具有最高風(fēng)險評分circTET2 繼續(xù)研究，通過RIP-qPCR確認了其存在m6A修飾（圖2F）。生存分析顯示，circTET2表達較高的患者OS要短得多（圖2G）。后續(xù)作者總結(jié)了患者臨床特征，并觀察到circTET2的表達與NOTCH1和TP53突變顯著相關(guān)（圖2H）。

3、circTET2在CLL中的特征刻畫

Divergent primer被設(shè)計用于擴增位于chr4q24上的circTET2;Sanger測序驗證了外顯子3的頭尾剪接（圖3A）;Northern印跡（圖3B）、RNase R處理（圖3C，D）和放線菌素D實驗（圖3E）證明了circTET2 的環(huán)形特征。核質(zhì)分離（圖3F）和FISH（圖3G）實驗顯示circTET2主要位于細胞質(zhì)中。為了探討circTET2的表達和定位是否受到m6A修飾的影響，作者用去甲基化酶抑制劑FB23-2處理細胞。FB23-2處理后，細胞中的m6A水平升高，而circTET2表達沒有顯示出顯著變化（圖3H，I）。然而，circTET2在細胞核中大量分布（圖3J–L）。這些發(fā)現(xiàn)表明m6A修飾通過控制circTET2的核質(zhì)分布進而影響其功能作用。

4、RBMX和YTHDC1調(diào)控circTET2的生物合成

CircRNA被認為是一種非常規(guī)的選擇性剪接產(chǎn)物，RBPs可以與circRNA的側(cè)翼內(nèi)含子結(jié)合，從而作為剪接因子。為了調(diào)查該過程中涉及的潛在RBP，作者使用了catRAPID和RBPBD兩個數(shù)據(jù)庫（圖4A）。在18個預(yù)測的RBPs中，作者發(fā)現(xiàn)剪接因子RBMX和YTHDC1與circTET2的側(cè)翼序列結(jié)合；通過設(shè)計的shRNA來敲低RBMX，顯著抑制了circTET2的表達（圖4B，C）。通過catRAPID獲得RBMX在側(cè)翼內(nèi)含子上的結(jié)合位點（a，b，c，d）（圖4D），RIP-qPCR分析顯示RBMX主要是在b、c和d位點上結(jié)合（圖4E）。YTHDC1是RBMX的相互作用伙伴，據(jù)報道其可影響甲基化后的mRNA和circRNA的核輸出。免疫共沉淀（Co-IP）分析驗證了RBMX和YTHDC1之間的相互作用（圖4F），YTHDC1沉默削弱了circTET2的表達（圖4G，H）。然而，在敲掉YTHDC1后，并沒有觀察到circTET2位置的變化（圖S5）。當評估CLL患者的RBMX和YTHDC1水平時，我們可以觀察到Y(jié)THDC1與RBMX或circTET2之間以及circTET2 RBMX之間呈正相關(guān)（圖4I，K）。

5、促進細胞增殖的circTET2參與mTORC1信號通路和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)

為了探索circTET2在CLL中的作用，作者對circTET2 相關(guān)基因進行了基因集富集分析（GSEA），結(jié)果顯示circTET2參與PI3K-AKT通路（圖5A）和mTORC1信號傳導(dǎo)（圖5B），以及脂質(zhì)代謝（圖5C）。然后，作者構(gòu)建了circTET2過表達或沉默的穩(wěn)定CLL細胞系（圖5D）。隨后CCK8分析表明circTET2促進了 CLL細胞的增殖（圖5E，F(xiàn)）。從這些結(jié)果中，我們觀察到circTET2的變化不會改變TET2蛋白水平，而circTET2的過表達激活了mTORC1途徑并增強了CPT1A和CPT1B的水平，而敲低circTET2則顯示出相反的結(jié)果（圖5G）。Seahorse檢測顯示，circTET2在 CLL細胞中的過表達導(dǎo)致更高的耗氧率（OCR），代表FAO水平（圖5H，I）；ATP水平測試顯示了一致的結(jié)果，表明circTET2促進了FAO（圖5J）。隨后使用FAO抑制劑（FAOi）Perhexiline maleate與over-circTET2聯(lián)合進行回復(fù)實驗進一步明確該環(huán)狀RNA的表型功能，同時也進一步明確了FAO在維持CLL細胞增殖方面發(fā)揮了重要作用。

6、circTET2以HNRNPC-CPT1A依賴的方式調(diào)節(jié)CLL細胞表型

越來越多的證據(jù)表明，circRNAs通過與RBPs的相互作用發(fā)揮功能。為了探索與circTET2結(jié)合的潛在RBPs，作者對RNA pull-down的蛋白質(zhì)進行了質(zhì)譜分析（圖6A）；同時，RBPsuit和catRAPID進行了生物信息學(xué)分析，以篩選circTET2可能結(jié)合的蛋白，最后確定HNRNPC是最有可能的RBP（圖6B，C）。隨后，RNA pull-down確認了circTET2和 HNRNPC之間的相互作用（圖6D）。RIP測定表明，在用抗HNRNPC的抗體沉淀的復(fù)合物中，circTET2被富集（圖6E）。FISH免疫熒光（FISH-IF）分析也驗證了兩種分子的共定位（圖6F）。雖然彼此物理結(jié)合時，作者注意到circTET2和HNRNPC 對它們的相互表達沒有影響（圖6G–I）。

由于CPT1A和CPT1B可能受到circTET2的調(diào)節(jié)，作者隨后評估了它們在HNRNPC耗竭后的變化，并注意到在HNRNPC敲除后，CPT1A，而非CPT1B的表達下調(diào)（圖6J，K）。據(jù)報道，細胞質(zhì)HNRNPC能調(diào)節(jié)靶基因的穩(wěn)定性。作者利用放線菌素D實驗證實了 HNRNPC調(diào)節(jié)CPT1A的穩(wěn)定性（圖6L）。Starbase 表明HNRNPC在CPT1A的3′UTR中含有潛在的結(jié)合位點。RBPmap進一步驗證了這一結(jié)果（圖6M），通過RBPsuit獲得了HNRNPC基序（圖6N），RIP 測定并確認該預(yù)測結(jié)果（圖6O）。更重要的是，在敲除circTET2后，HNRNPC和CPT1A mRNA之間的相互作用顯著減少（圖6O）。進一步的結(jié)果表明，circTET2對CPT1A的穩(wěn)定性有影響（圖6P）。然后，過表達CPT1A并敲低circTET2，可以觀察到升高的CPT1A水平被抑制（圖6Q）。為了確認 circTET2是否通過HNRNPC和CPT1A發(fā)揮作用，作者進行了CCK8測定，發(fā)現(xiàn)circTET2對sh-HNRNPC 誘導(dǎo)的細胞增殖能力降低至關(guān)重要（圖6R）。此外，CCK8測定還證實，隨著circTET2的沉默，CPT1A誘導(dǎo)的細胞活力顯著降低（圖6S）。隨后，進行基于HNRNPC和CPT1A表達的OS曲線被繪制。與預(yù)期一致，較高的HNRNPC和CPT1A水平預(yù)示著 CLL患者的OS較差（圖6T，U）?？傊@些結(jié)果表明circTET2以HNRNPC-CPT1A依賴的方式調(diào)節(jié)CLL 細胞相關(guān)表型。

7、CP028、Dactolisib和Perhexiline對CLL細胞的影響

鑒于circTET2在CLL中的致癌作用，作者認為靶向circTET2可以成為一種潛在的治療策略。已有研究表明靶向剪接因子是一種新的腫瘤治療策略，由于circTET2受到剪接過程和RBP的調(diào)節(jié)，作者試圖發(fā)現(xiàn)靶向circTET2的剪接因子抑制劑。因此，作者采用了五種抑制劑：Disoulam（通過誘導(dǎo)RBM39降解靶向剪接）、H3B-8800（SF3b復(fù)合體的調(diào)節(jié)劑）以及三種 pre-mRNA剪接抑制劑Isoginkgetin、Madrasin和CP028。其中，CP028顯著降低了circTET2的水平（圖7A）。此外，在用剪接抑制劑處理后，CP028減弱了RBMX和YTHDC1表達（圖7B）。這一結(jié)果進一步明確RBMX和YTHDC1是circTET2剪接過程和環(huán)化的潛在調(diào)節(jié)因子。同時，CP028的使用顯著抑制了細胞活力并促進了細胞凋亡（圖7C，D），而其他四種抑制劑也顯示出明顯的抑制作用（圖S6C）。雙ATP競爭性PI3K和mTOR抑制劑Dactolisib也對MEC-1細胞產(chǎn)生顯著影響（圖7E）。然而，Datolisib下調(diào)mTORC1信號的同時，誘導(dǎo)了CPT1A的表達（圖7F，G）。用Perhexiline處理則激活了p-4EBP1和p-S6 的磷酸化，這一激活作用可通過沉默circTET2減輕（圖7H）。

因此，推測并證實了Dactolisib和Perhexiline可能具有協(xié)同作用（圖7I，J）。Perhexiline誘導(dǎo)的p-4EBP1和p-S6的增強水平也通過聯(lián)用Dactolisib而下調(diào)（圖7K）。流式細胞術(shù)分析證實，與單一藥物治療相比，聯(lián)合用藥的細胞凋亡率更顯著（圖7L）。通過臺盼藍染色，在CLL者的原代細胞中進一步驗證了藥物的協(xié)同作用（圖7M），這些結(jié)果表明了它們在CLL中的潛在治療策略。

本文通過構(gòu)建m6Sig評分揭示了m6A在CLL中的預(yù)后意義，表明m6Sig低的患者具有更長的生存時間。進一步篩選m6A相關(guān)的circRNA構(gòu)建的風(fēng)險預(yù)后評估模型表明circTET2能作為CLL的預(yù)后標志物。但由于僅僅研究了53例樣品，不同群體可能存在遺傳或環(huán)境的異質(zhì)性，因此，circTET2在臨床方面的應(yīng)用仍需進一步研究。

另外，本文研究揭示了circTET2的環(huán)化被RBMX和YTHDC1協(xié)同調(diào)控，雖然之前的研究表明YTHDC1作為m6A reader促進circNSUN2出核，但本文發(fā)現(xiàn)m6A修飾會抑制circTET2從核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)的過程——這種機制可能是m6A影響了circTET2的空間結(jié)構(gòu)，從而影響了其細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，具體機制仍需進一步研究。

CLL細胞存在代謝重編程，本文研究發(fā)現(xiàn)circTET2 參與了CLL的代謝通路。circTET2與HNRNPC相互作用激活了PI3K-AKT-mTORC1信號通路，并通過CPT1A加速了FAO(脂肪酸氧化)的過程。FAO促使ATP產(chǎn)生，從而為CLL細胞增殖提供代謝需求。

已有研究證實FAO的抑制作用可以顯著降低CLL細胞的耐藥性并改善患者的臨床結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)FAO 抑制劑Perhexiline確實能削弱CLL細胞的活性；當聯(lián)用Dactolisib時，CLL殺傷效果得到了增強。

總的來說，本研究證明了m6A在CLL患者中的預(yù)后意義，并確定m6A修飾的circTET2是CLL的預(yù)后標志物。在CLL中高表達的circTET2由剪接因子RBMX 和YTHDC1調(diào)節(jié)。circTET2與HNRNPC相互作用，似乎參與了FAO和mTORC1信號通路的調(diào)節(jié)，以提供能量需求并促進CLL細胞的增殖。mTOR和FAO 的聯(lián)合抑制顯示出增強的效果，這為CLL的治療提供了一種新的治療策略。這項研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)為circRNA在CLL脂質(zhì)代謝中的作用和潛在機制提供了新的證據(jù)，提示了臨床治療中新的潛在治療靶點。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1002/advs.202304895