上一篇小源給大家介紹了iPSC在CRISPR/Cas9技術(shù)加持下，廣泛應(yīng)用于疾病建模、藥物篩選和基因治療的相關(guān)案例（圖1），沒有看過的小伙伴可以點擊回顧原文>>當(dāng)iPSC與CRISPR/Cas9完美相遇，會碰撞出哪些火花？。文章發(fā)布后，收到不少粉絲的咨詢，比如自己想要構(gòu)建iPS基因編輯細(xì)胞，但是感覺困難重重，光是細(xì)胞培養(yǎng)就耗費了九牛二虎之力，單克隆制備也是嘗盡各種方法才獲得寥寥數(shù)幾，更不用說千辛萬苦養(yǎng)大的克隆做完基因型鑒定才發(fā)現(xiàn)沒有陽性，真是欲哭無淚……

作為也曾在實驗室奮戰(zhàn)到凌晨2點的生物科研汪，小源真是太了解這種感受了，這不快馬加鞭地整理了iPS細(xì)胞基因編輯難點與如何提升效率的方法分享給大家，希望可以幫到大家。

iPS細(xì)胞培養(yǎng)難

1）iPS細(xì)胞活力較差，容易分化而失去干性；

iPS細(xì)胞比較嬌貴，不能像腫瘤細(xì)胞一樣“散養(yǎng)”，以下是維持細(xì)胞活力和干性的一些技巧：最基礎(chǔ)的問題是培養(yǎng)基和基質(zhì)的選擇，在這一點上必須選擇高質(zhì)量的試劑以確保能提供足夠的營養(yǎng)和舒適的生長環(huán)境。復(fù)蘇時使用的培養(yǎng)體系建議與凍存前一致，如果考慮更換培養(yǎng)基或基質(zhì)替代品，則只能在傳代期間進(jìn)行更換，且需要給細(xì)胞一些時間來適應(yīng)。再者，不同于其他可以兩三天更換一次培養(yǎng)基的細(xì)胞，iPS細(xì)胞需要每天更換新鮮的培養(yǎng)基，并及時傳代以免集落生長過大或相互接觸導(dǎo)致細(xì)胞活性差、易分化，傳代時也要注意細(xì)胞不能被酶過度消化。不僅如此，iPS細(xì)胞的培養(yǎng)還需要不斷的關(guān)注與呵護(hù)，這包括但不限于每天在相差顯微鏡（4x、10x、20x和40x放大倍數(shù)）下觀察iPSC細(xì)胞系，監(jiān)測iPSC集落形態(tài)、是否出現(xiàn)分化以及匯合度（圖2）。iPSC理想的集落應(yīng)該是內(nèi)部緊實、大小均勻且邊緣清晰，如果邊緣出現(xiàn)少量分化細(xì)胞，應(yīng)及時干預(yù)以維持iPSC的多能性及對數(shù)期生長。

2）單克隆制備復(fù)雜，克隆形成率較低。

單克隆生長與擴(kuò)增是獲得陽性克隆的關(guān)鍵階段，此過程本身既耗時又費力，如果單克隆形成率低，工作量又是翻倍。鋪克隆前的細(xì)胞狀態(tài)非常重要，細(xì)胞狀態(tài)越好，單克隆形成率越高。此外，iPS被消化為單個細(xì)胞后容易凋亡，必須添加合適的凋亡抑制劑才能讓單克隆更好的生長。

針對這一需求，源井生物研發(fā)了EZ-Stem?干細(xì)胞完全培養(yǎng)基套裝，該套裝不僅適用于iPS細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)，更適用于基因編輯iPS細(xì)胞培養(yǎng)及鋪單克隆前的狀態(tài)調(diào)整，充分保護(hù)iPS單細(xì)胞，顯著提升單克隆形成率，歡迎復(fù)制鏈接了解產(chǎn)品詳情>>https://www.ubigene.com/ez_editor/?cate=19

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iPS細(xì)胞基因編輯效率低

1）方案設(shè)計與轉(zhuǎn)染率

? ? ? iPS基因編輯項目的成功與否，CRISPR/Cas9方案設(shè)計至關(guān)重要，對敲除項目而言，敲除大小的選擇、sgRNA的特異性和切割效率都影響著項目的陽性率，而對點突變或基因敲入而言，還需要優(yōu)先考慮切割位置與突變位置/敲入位置的距離、PAM位置的同義突變引入和Donor同源臂的設(shè)計和修飾等，一套好的編輯方案是項目成功開展的基礎(chǔ)。另外，不同個體和組織來源的iPS差異較大，轉(zhuǎn)染方法和參數(shù)都可能不一樣，需要針對每一株iPS進(jìn)行預(yù)實驗，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，提高轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染率的提升也可以大大增加基因編輯成功率。

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2）?HDR效率

? ? ? 相比敲除，iPSC在點突變和基因敲入時更難以編輯，主要原因在于：與永生細(xì)胞系相比，iPSC細(xì)胞中定向同源重組修復(fù)(HDR)?的效率低[1]。而HDR是外源供體DNA用于修復(fù)CRISPR誘導(dǎo)的雙鏈斷裂的主要方法。為了克服低HDR效率，研究人員采用了幾種策略，例如：在CRISPR質(zhì)?；蚬wDNA上加入抗性基因，這種方法雖然有效但會將外源DNA插入到基因組中[2]；將陽性選擇標(biāo)記基因與允許切除可選擇標(biāo)記基因（例如?Cre/lox?系統(tǒng)或PiggyBAC轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)）相結(jié)合可以提高HDR效率，但其構(gòu)建周期也顯著延長[3]；單鏈寡核苷酸（ssODN）供體分子的方法雖然避免了較大的雙鏈DNA分子存在隨機整合的問題，但依然受到受到修復(fù)成功率低和雙鏈斷裂位點周圍的序列錯亂的問題[4]；還有使用已知的細(xì)胞周期化學(xué)抑制劑同步細(xì)胞周期以達(dá)到Cas9 RNP復(fù)合物定時投送的目的[5]以及使用小分子化合物抑制非同源末端直接連接（NHEJ）等方法。其中，添加NHEJ抑制劑的操作比較方便，效率提升也比較明顯，是比較常用的改進(jìn)方法。

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3）基因型分析

????? 前面提到iPSC單克隆制備的工作量非常龐大，那么在進(jìn)行單克隆鋪板前，應(yīng)該對pool細(xì)胞進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，確保pool細(xì)胞水平有效果后再進(jìn)行單克隆操作。源井GAS基因型分析系統(tǒng)，可以用于pool基因型分析，確認(rèn)編輯效率，指導(dǎo)是否鋪板以及需鋪板的數(shù)量，還可以實現(xiàn)單克隆基因型讀取高通量自動化，自動篩選陽性克隆，節(jié)省大量的人工，可點擊體驗>>

案例:在ipsc細(xì)胞中用RNP的方法對APP基因進(jìn)行c.G2149T點突變，轉(zhuǎn)染后先檢測pool重組效率，根據(jù)sanger測序結(jié)果可以看出gRNA有顯著切割效果（圖3），根據(jù)EZ-editor GAS小工具分析出同源重組基因型占比14%（圖4），效率較高，可以進(jìn)行單克隆鋪板。

難點和解決方法都給你盤好，請大膽實操吧！

若仍是沒有把握，源井生物能為你提供iPS細(xì)胞敲除/敲入/點突變定制服務(wù)，豐富的iPS細(xì)胞基因編輯經(jīng)驗保證交付優(yōu)質(zhì)iPSC基因編輯細(xì)胞株：精研干細(xì)胞相關(guān)培養(yǎng)基輕松駕馭iPSC細(xì)胞培養(yǎng)，對于不同來源的iPS細(xì)胞至少測試3種轉(zhuǎn)染方案確保轉(zhuǎn)染效率，加上獨特的EZ-editor?單克隆鑒定技術(shù)，可快速實現(xiàn)高通量陽性克隆篩選，復(fù)制鏈接可以了解iPSC敲除/點突變/敲入服務(wù)詳情>>https://www.ubigene.com/service/cell/3107.html

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參考文獻(xiàn)：

[1]?Hockemeyer D, Jaenisch R. Induced pluripotent stem cells meet genome editing[J]. Cell stem cell, 2016, 18(5): 573-586.

[2]?Zhang Y, Schmid B, Nielsen T T, et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line via CRISPR-Cas9 mediated integration of a site-specific homozygous mutation in CHMP2B[J]. Stem cell research, 2016, 17(1): 151-153.

[3]?Yusa K, Rashid S T, Strick-Marchand H, et al. Targeted gene correction of α1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells[J]. Nature, 2011, 478(7369): 391-394.

[4]?Yang L, Guell M, Byrne S, et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing[J]. Nucleic acids research, 2013, 41(19): 9049-9061.

[5]?Lin S, Staahl B T, Alla R K, et al. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery[J]. elife, 2014, 3: e04766.