寫在前面

????????今天推薦的是由浙江大學(xué)藥學(xué)院在2020年3月26日發(fā)表于Cancer Research（2020IF：12.702，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Bo Yang教授，研究表明USP10通過去泛素化和穩(wěn)定YAP/TAZ促進(jìn)肝細(xì)胞癌的增殖。

研究背景

????????Yes 相關(guān)蛋白 (YAP) 及其旁系同源物、具有PDZ 結(jié)合基序 (TAZ) 的轉(zhuǎn)錄共激活因子在促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，肝細(xì)胞癌中支持YAP/TAZ異常激活的調(diào)控機制仍不清楚。

摘要部分

????????在這項研究中，作者全面分析了去泛素化酶 (DUB) 對肝細(xì)胞癌模型中YAP/TAZ轉(zhuǎn)錄活性和蛋白質(zhì)豐度的貢獻(xiàn)，并確定了泛素特異性肽酶10 (USP10) 作為有效的YAP/TAZ激活DUB。從機制上講，USP10通過恢復(fù)它們的蛋白水解泛素化直接與YAP/TAZ相互作用并穩(wěn)定它們。USP10的敲低增強了YAP/TAZ的多泛素化，促進(jìn)了它們的蛋白酶體降解，并最終在體外和體內(nèi)阻止了肝細(xì)胞癌的增殖。USP10的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者樣本以及亞硝基二乙胺 (DEN) 誘導(dǎo)的肝癌小鼠模型中YAP/TAZ的豐度呈正相關(guān)?？偟膩碚f，這項研究建立了USP10與肝細(xì)胞癌細(xì)胞中過度活化的YAP/TAZ之間的因果關(guān)系，并為治療具有高水平Y(jié)AP/TAZ的肝癌患者的潛在治療干預(yù)提供了理論依據(jù)。

研究內(nèi)容

1.鑒定USP10作為YAP/TAZ信號的新調(diào)節(jié)器

????????作者首先通過監(jiān)測YAP/TAZ依賴性轉(zhuǎn)錄熒光素酶報告基因進(jìn)行了功能增益篩選。其中，USP10 siRNA 對YAP/TAZ-TEADs熒光素酶活性的抑制作用最強。為了進(jìn)一步證實USP10對YAP/TAZ信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用，作者使用 WWTR1熒光素酶融合構(gòu)建體進(jìn)行了另一次篩選。兩種熒光素酶報告系統(tǒng)都表明USP10以最佳方式誘導(dǎo)YAP/TAZ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。另一方面，內(nèi)源性USP10的缺失有力地降低了YAP/TAZ的轉(zhuǎn)錄活性以及蛋白質(zhì)豐度。一致地，在HepG2和Bel-7402細(xì)胞中引入外源USP10也大大上調(diào)了YAP/TAZ的蛋白質(zhì)水平。

研究結(jié)論：鑒定USP10作為YAP/TAZ信號的新調(diào)節(jié)器，USP10可以正向調(diào)節(jié)YAP/TAZ的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄功能。

?

2.USP10通過去泛素酶活性穩(wěn)定YAP/TAZ? ? ?

????????作者在HepG2和Bel-7402細(xì)胞系中過表達(dá)USP10的WT或催化失活突變體（CA），并發(fā)現(xiàn) WTUSP10而非CA突變體增加了YAP/TAZ蛋白水平。穩(wěn)定表達(dá)對照 shRNA 或USP10shRNA 的細(xì)胞用放線菌酮（一種蛋白質(zhì)合成的通用抑制劑）處理。半衰期分析表明，TAZ蛋白在USP10缺陷細(xì)胞中更加穩(wěn)定?？傊?，這些結(jié)果表明USP10通過去泛素化酶活性調(diào)節(jié)YAP/TAZ穩(wěn)定性。? ? ?

????????作者試圖進(jìn)一步確認(rèn)USP10通過泛素-蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)YAP/TAZ的周轉(zhuǎn)。用蛋白酶體抑制劑MG132處理USP10缺陷細(xì)胞后，作者發(fā)現(xiàn)因USP10敲低而降低的YAP/TAZ蛋白質(zhì)水平恢復(fù)了。作者接下來檢查了YAP/TAZ的下游靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)USP10的缺失顯著降低了YAP/TAZ的靶基因Birc5和CYR61的表達(dá)水平。相比之下，MG132 對YAP/TAZ降解的破壞減輕了Birc5和CYR61水平的降低。

????????為了確定USP10是否直接調(diào)節(jié)YAP/TAZ，作者進(jìn)一步研究了USP10如何影響YAP/TAZ的上游激酶 LATS1/2。無論是USP10過表達(dá)還是USP10敲低都不會導(dǎo)致 LATS1、LATS2 或 p-LATS1發(fā)生顯著變化，因此排除了這些典型上游調(diào)節(jié)因子通過USP10參與YAP/TAZ調(diào)節(jié)的可能性。此外，作者通過將b-TrCP和Cullin 1轉(zhuǎn)染到HEK293FT細(xì)胞中，進(jìn)一步評估了USP10拮抗E3連接酶介導(dǎo)的TAZ降解的能力，發(fā)現(xiàn)TAZ蛋白水平如預(yù)期的那樣下調(diào)，而USP10過表達(dá)消除了TAZ降解。

研究結(jié)論：USP10以蛋白酶體依賴性方式調(diào)節(jié)YAP/TAZ穩(wěn)定性及其下游活性。

?

3.USP10與YAP/TAZ相互作用并使其去泛素化? ???

????????隨后作者探究USP10是否通過與這對直接相互作用來調(diào)節(jié)YAP/TAZ。作者將外源性TAZ和USP10轉(zhuǎn)染到HEK293FT細(xì)胞中，共免疫沉淀（co-IP）測定表明TAZ確實與USP10發(fā)生了物理相互作用。重要的是，作者單獨轉(zhuǎn)染了TAZ，結(jié)果顯示TAZ也可以與內(nèi)源性USP10相互作用。在與抗 Flag 抗體的相互co-IP中，還發(fā)現(xiàn)外源USP10與TAZ-GFP融合蛋白接觸，其中引入了GFP標(biāo)記以更好地說明TAZ信號。一致地，內(nèi)源性USP10也與TAZ共同IP。類似的結(jié)果證明了YAP-USP10相互作用。此外，作者進(jìn)一步證實了USP10和YAP/TAZ之間的內(nèi)源性相互作用，這與從內(nèi)源性水平的co-IP實驗中獲得的數(shù)據(jù)一致。

????????接下來，作者試圖探究USP10是否可以去除YAP/TAZ的多泛素化。USP10而非USP10-CA 的過表達(dá)顯著降低了YAP/TAZ的泛素化水平。一致地，USP10敲低顯著增加了泛素化TAZ的水平。然后作者使用細(xì)菌表達(dá)的USP10在體外進(jìn)行了去泛素化分析。另一方面，純化的USP10在體外也能有效地去泛素化YAP/TAZ。

研究結(jié)論：USP10直接與YAP/TAZ相互作用并使其去泛素化，進(jìn)一步證實USP10作為DUB調(diào)節(jié)YAP/TAZ。

?

4.USP10敲低通過抑制YAP/TAZ通路來損害肝細(xì)胞癌細(xì)胞和異種移植腫瘤的生長? ? ?

????????許多研究已經(jīng)證明YAP/TAZ促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖。作者因此探究USP10是否可以通過介導(dǎo)YAP/TAZ來影響肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。作者發(fā)現(xiàn)在HepG2中穩(wěn)定沉默USP10會明顯抑制細(xì)胞生長，如SRB試驗和集落形成實驗所測量的那樣。此外，在那些USP10缺陷細(xì)胞中，TAZ的蛋白質(zhì)水平明顯下調(diào)。

????????為了進(jìn)一步證實YAP/TAZ參與USP10對腫瘤生長的調(diào)節(jié)，作者將YAP WT 或YAP-5SA突變體引入USP10缺陷細(xì)胞。YAP-5SA 缺乏五個絲氨酸磷酸化殘基，主要位于細(xì)胞核中。只有核定位的YAP-5SA，而不是YAP WT，避免了USP10敲低增強的細(xì)胞質(zhì)降解，并逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞增殖和集落形成的減少。

????????接下來，為了驗證USP10對體內(nèi)細(xì)胞生長的影響，作者將缺乏USP10的HepG2細(xì)胞皮下注射到裸鼠中，并每2天測量一次腫瘤大小。USP10的敲低幾乎完全抑制了HepG2異種移植腫瘤的生長。作者進(jìn)一步檢查了USP10在肝細(xì)胞癌患者來源的異種移植 (PDX) 模型中的功能。慢病毒載體的瘤內(nèi)注射遞送USP10 shRNA 顯著延遲 PDX 腫瘤生長。為了進(jìn)一步闡明USP10抑制是否能夠干擾異種移植模型中的YAP/TAZ通路，作者接下來檢測了YAP和TAZ的瘤內(nèi)蛋白水平，并發(fā)現(xiàn) shUSP10治療的PDX腫瘤中YAP和TAZ顯著降低。這些數(shù)據(jù)共同表明，抑制USP10通過抑制YAP和TAZ豐度來阻止體內(nèi)腫瘤生長。為了證實YAP/TAZ在USP10調(diào)節(jié)的體內(nèi)腫瘤生長中的作用，作者評估了核駐留的YAP-5SA 突變體對USP10 shRNA 介導(dǎo)的HepG2異種移植腫瘤的腫瘤抑制的影響。USP10 shRNA完全阻斷了腫瘤生長，而YAP-5SA的引入減弱了USP10 shRNA介導(dǎo)的生長抑制，表明對YAP的調(diào)節(jié)作用對于USP10促進(jìn)體內(nèi)肝細(xì)胞癌腫瘤的生長至關(guān)重要。

研究結(jié)論：USP10敲低通過抑制YAP/TAZ通路來損害肝細(xì)胞癌細(xì)胞和異種移植腫瘤的生長。

?

5.USP10表達(dá)與YAP/TAZ水平和患者肝細(xì)胞癌風(fēng)險呈正相關(guān)

????????為了進(jìn)一步研究USP10是否參與了肝細(xì)胞癌形成的病理改變，作者在 C57BL/6 小鼠中建立了DEN 誘導(dǎo)的肝細(xì)胞腫瘤發(fā)生模型然后進(jìn)行HA染色以驗證腫瘤形成。作者發(fā)現(xiàn)USP10和YAP/TAZ的表達(dá)在腫瘤區(qū)域比在同一肝臟的非腫瘤區(qū)域顯著升高。此外，作者使用IHC染色評估了肝癌患者的微陣列組織中USP10和YAP/TAZ的表達(dá)。大多數(shù)腫瘤標(biāo)本表達(dá)大量的USP10和YAP/TAZ。此外，在USP10和YAP/TAZ水平之間發(fā)現(xiàn)了統(tǒng)計學(xué)上顯著的相關(guān)性。

????????接下來，我們試圖通過使用癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫和Kaplan-Meier繪圖儀分析來確認(rèn)USP10的臨床意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)人肝細(xì)胞癌樣本的USP10表達(dá)水平明顯高于非腫瘤組織。值得注意的是，USP10表達(dá)水平與患者患肝細(xì)胞癌的風(fēng)險相關(guān)，這促使作者調(diào)查USP10表達(dá)升高是否可以預(yù)測肝細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后。正如Kaplan-Meier繪圖儀分析所示，USP10的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者的無進(jìn)展生存期（PFS）呈負(fù)相關(guān)，突出了USP10在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后中的關(guān)鍵作用。此外，在肝細(xì)胞癌患者中檢測到USP10的表達(dá)水平與YAP/TAZ靶基因的表達(dá)水平之間存在明顯的正相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)與作者的IHC染色結(jié)果一致。

研究結(jié)論：SP10通過穩(wěn)定YAP/TAZ促進(jìn)肝細(xì)胞腫瘤發(fā)生，可作為肝細(xì)胞癌治療的潛在治療靶點。

?

結(jié)論與討論

????????總之，作者研究確定USP10為一種新型去泛素化介質(zhì),可穩(wěn)定肝癌中的YAP/TAZ并增強下游致癌反應(yīng)。USP10在肝癌組織和DEN誘導(dǎo)的肝細(xì)胞腫瘤發(fā)生中的高豐度證實了USP10作為一種重要的腫瘤促進(jìn)因子，是肝細(xì)胞癌干預(yù)的新治療靶點。

?

Thank you!

?

原文鏈接：https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-19-2388