|?細(xì)胞換液?

所需試劑

細(xì)胞完全培養(yǎng)基

★ 推薦使用海星生物細(xì)胞配套專用培養(yǎng)基

1. 細(xì)胞處理后的第二天，在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，如死細(xì)胞較多且細(xì)胞密度較低，需要進(jìn)行換液操作。

? （1）懸浮細(xì)胞請在高倍鏡下觀察，一般而言，活細(xì)胞輪廓圓潤、界限清晰、透明度大、折光性強。如細(xì)胞活率較高，則繼續(xù)正常培養(yǎng)。

? （2）貼壁細(xì)胞如觀察到較多細(xì)胞漂浮，請在高倍鏡下觀察，判斷漂浮著的細(xì)胞是死細(xì)胞還是暫未貼壁的活細(xì)胞。如細(xì)胞活率較高，則繼續(xù)正常培養(yǎng)。

? （3）半貼壁細(xì)胞正常培養(yǎng)會有部分細(xì)胞漂浮，屬正常現(xiàn)象。請在高倍鏡下觀察，判斷漂浮著的細(xì)胞是否是死細(xì)胞。如細(xì)胞活率較高，則繼續(xù)正常培養(yǎng)。

2. 如需換液，參考以下步驟：

?（1）懸浮細(xì)胞：收集培養(yǎng)容器中的所有細(xì)胞懸液。250 g離心4 min后棄去上清。使用預(yù)熱的完全培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞懸液接種到合適的培養(yǎng)容器中。

?（2）貼壁細(xì)胞：直接棄去培養(yǎng)容器中的上清，添加預(yù)熱的完全培養(yǎng)基至原培養(yǎng)容器中。

?（3）半貼壁細(xì)胞：收集培養(yǎng)容器上清中的所有細(xì)胞，250 g離心4 min后棄去上清。使用預(yù)熱的完全培養(yǎng)基重懸，接種至原培養(yǎng)容器中。

3. 之后，每2~3天更換一次完全培養(yǎng)基，后續(xù)根據(jù)細(xì)胞生長密度和狀態(tài)傳代或凍存。

? ??注意: 若發(fā)現(xiàn)異常情況，應(yīng)及時排查原因，并與我們聯(lián)系。

|?細(xì)胞傳代?

所需試劑

細(xì)胞完全培養(yǎng)基

貼壁和半貼壁細(xì)胞需要同時準(zhǔn)備以下試劑：

0.25% Trypsin-0.04% EDTA（貨號: GUTP-R001，以下簡稱胰酶）

1×PBS（貨號: GUPB-R001，以下簡稱PBS）

1. 預(yù)熱完全培養(yǎng)基（貼壁和半貼壁細(xì)胞還需要預(yù)熱胰酶和PBS）。

2. 細(xì)胞收集。

?（1）懸浮細(xì)胞直接收集培養(yǎng)容器中的所有細(xì)胞懸液至離心管中。

?（2）貼壁/半貼壁細(xì)胞需要對細(xì)胞進(jìn)行消化處理，步驟如下：

? ? ? ? ?①?用PBS洗滌細(xì)胞2次。洗滌過程中注意動作輕柔，清洗全面。

? ? ? ? ?貼壁細(xì)胞直接棄去培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)上清。用PBS洗滌細(xì)胞2次，洗滌后的PBS直接棄去，無需保留。

? ? ? ? ?半貼壁細(xì)胞需收集培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)上清至離心管中。用PBS洗滌細(xì)胞2次，洗滌后的PBS需收集至離心管中。

? ? ? ? ② 加入胰酶，迅速鋪勻，確保其充分接觸細(xì)胞表面。

? ? ? ??③?顯微鏡下觀察消化情況，約70%~80%細(xì)胞收縮變圓后，輕拍培養(yǎng)容器外壁，使細(xì)胞脫離培養(yǎng)容器底面。立即加入胰酶雙倍體積的完全培養(yǎng)基，輕搖培養(yǎng)容器，使培養(yǎng)基和胰酶迅速混勻，終止消化。

? ? ? ? ④?吸取細(xì)胞懸液，吹打培養(yǎng)容器底面數(shù)次，盡可能將細(xì)胞都吹打下來。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中。

3. PBS洗滌培養(yǎng)容器1~2次，收集所有細(xì)胞懸液至離心管中。

4. 收集的所有細(xì)胞懸液250 g離心4 min。

5. 離心后去除上清。加入2 mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，輕柔吹打細(xì)胞沉淀，充分吹散、混勻。

6. 將細(xì)胞按(2.5~4.0) ×104個活細(xì)胞/cm2接種至適宜的培養(yǎng)容器內(nèi)。

? ??注意:?如未計數(shù)，也可按照適宜比例進(jìn)行傳代，但請根據(jù)細(xì)胞實際生長情況靈活調(diào)整傳代比例。

7. 搖勻細(xì)胞，將培養(yǎng)容器放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

8. 后續(xù)根據(jù)細(xì)胞生長密度和狀態(tài)進(jìn)行補液（懸浮細(xì)胞）/換液（貼壁/半貼壁細(xì)胞）、傳? ?代或凍存等操作。

|?細(xì)胞凍存?

所需試劑

凍存液

★ 推薦使用海星HyCyteTM一步凍存液（即用型、無血清、無需程序降溫）

貨號：GUCP-R201

1. 待細(xì)胞生長至可傳代的密度，即可準(zhǔn)備凍存。

2. 消化細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸液計數(shù)。細(xì)胞懸液經(jīng)250 g離心4 min。

3. 離心后去除上清，用適量4℃預(yù)冷的凍存液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞按比例或數(shù)量分裝至凍存管中。一般凍存密度為(1.0~2.0)×106個/mL。

????注意:?細(xì)胞長時間在非培養(yǎng)條件下放置會嚴(yán)重影響細(xì)胞的狀態(tài)。如離心后用凍存液重懸計數(shù)，請將細(xì)胞放置于4℃冰箱內(nèi)，以減弱細(xì)胞代謝，較好的保持細(xì)胞狀態(tài)。

4. 如使用海星一步凍存液，凍存管直接豎直放入-80℃冰箱即可完成“一步”凍存。如使用程序凍存液，需將凍存管放入提前預(yù)冷的程序降溫盒后放入-80℃冰箱。

5. 24小時后可將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮進(jìn)行長期保存。

? ? 注意:?細(xì)胞不可長期保存在-80℃冰箱中。建議24 h后盡快轉(zhuǎn)移至液氮中。

|?細(xì)胞復(fù)蘇?

所需試劑

細(xì)胞完全培養(yǎng)基

★ 推薦使用海星生物細(xì)胞配套專用培養(yǎng)基

1. 開啟37℃水浴鍋。預(yù)熱完全培養(yǎng)基，提前將細(xì)胞從液氮中取出，放于-80℃冰箱，讓凍存管中液氮揮發(fā)。

2. 潔凈工作臺內(nèi)準(zhǔn)備15 mL離心管，加入5 mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)基。

3. 從-80℃冰箱中取出細(xì)胞?？焖賹龃婀苤糜?7℃水浴鍋內(nèi)，快速晃動，使凍存液迅速融化。

? ??注意:?① 融化過程必須晃動凍存管，保證凍存液融化均勻?；蝿訒r應(yīng)避免水沒過管蓋增加污染風(fēng)險。

? ? ? ? ? ? ?②?管內(nèi)凍存液融化至只剩一個約2mm直徑的冰晶時，可停止水浴。繼續(xù)晃動凍存管至冰晶融化。

4. 用75%酒精消毒凍存管表面。在潔凈工作臺內(nèi)小心開蓋，盡量避免氣泡溢出，輕柔吹打數(shù)次，轉(zhuǎn)移至預(yù)先準(zhǔn)備的離心管內(nèi)。用少量完全培養(yǎng)基洗滌凍存管1~2次，一并收集至離心管內(nèi)。

5. 250 g離心4 min。離心后去除上清。加入2 mL完全培養(yǎng)基，輕柔吹打細(xì)胞沉淀，充分吹散、混勻。（如有臺盼藍(lán)可取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行染色計數(shù)）

6. 將細(xì)胞平均接種到1個T25培養(yǎng)瓶或底面積相當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)容器中，加入足量完全培養(yǎng)基，搖勻細(xì)胞，將培養(yǎng)容器放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7. 復(fù)蘇次日，觀察細(xì)胞狀態(tài)并換液，具體操作見”細(xì)胞換液”。

? ? 注意:?貼壁/半貼壁細(xì)胞接種24 h內(nèi)不應(yīng)擾動。部分細(xì)胞貼壁較慢，復(fù)蘇后48 h不應(yīng)擾動，具體注意事項見相應(yīng)細(xì)胞說明書。

細(xì)胞處理原則

? ·?嚴(yán)格的無菌環(huán)境。務(wù)必保證實驗室、超凈臺/生物安全柜和培養(yǎng)箱的清潔。

? ·?規(guī)范的操作方式。請按照操作說明描述的方式操作，注意操作細(xì)節(jié)。

? ·?需要合適的、質(zhì)量可靠的實驗耗材和試劑。使用的試劑必須經(jīng)驗證可靠，適宜細(xì)胞生長且批間差異小。

作者：海星生物

公眾號：Cas9X細(xì)胞基因敲除

以上內(nèi)容由海星生物（http://www.cas9x.com)提供?

我們的服務(wù)：CRISPR/Cas9細(xì)胞基因編輯、載體構(gòu)建/病毒包裝、分子診斷標(biāo)準(zhǔn)品/突變基因標(biāo)準(zhǔn)品/融合基因標(biāo)準(zhǔn)品、細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)/細(xì)胞干擾

我們的產(chǎn)品：HyCyte干細(xì)胞/原代細(xì)胞/細(xì)胞株、三系誘導(dǎo)培養(yǎng)試劑、ClonePlus 專用培養(yǎng)基、基因編輯試盒、病毒現(xiàn)貨、細(xì)胞專用血清