Front Mol Biosci 期刊上，影響因子為5。

糖尿病腎病是糖尿病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，也是導(dǎo)致腎衰竭的主要因素。其特點(diǎn)是進(jìn)行性腎功能損害、腎小球濾過率惡化、血清肌酐水平升高、高血壓和高死亡率。然而，這兩個指標(biāo)的特異性和可靠性都很有限。近年來，研究人員探索了與 DN 的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的各種生物標(biāo)志物和分子途徑。DN 的一個研究領(lǐng)域是對鐵凋亡的研究。

1. 數(shù)據(jù)歸一化和差異表達(dá)基因（DEGs）分析

GSE30122 數(shù)據(jù)集是從 GEO 數(shù)據(jù)庫下載的，其歸一化結(jié)果如圖 1A 和圖 B 所示。對數(shù)據(jù)集進(jìn)行預(yù)處理后，確定了 392 個 DEGs，其中上調(diào)基因 188 個，下調(diào)基因 204 個（圖 1C）。FRGs 來自 GeneCards 數(shù)據(jù)庫。根據(jù) GeneCards 數(shù)據(jù)庫，51 個 FRGs 被鑒定為 DEGs（圖 1D）。

圖1 數(shù)據(jù)預(yù)處理和 DEGs 篩選

2.不同表達(dá)的 FRGs 的 GO 和 KEGG 分析

GO富集結(jié)果顯示，這些基因主要參與凋亡信號通路、細(xì)胞對氧化應(yīng)激和化學(xué)應(yīng)激的調(diào)控（圖2A、B）。KEGG分析顯示，這些基因主要與血脂和動脈粥樣硬化、p53信號通路和mTOR信號通路有關(guān)（圖2C和D）。

圖2 差異表達(dá)的 FRGs 的 GO 和 KEGG 富集分析

3.差異表達(dá)的 FRGs 的 GSEA 分析

如圖 3A、B 所示，作者通過 GSEA 發(fā)現(xiàn)，與對照腎臟相比，DN 腎組織中的多個生物學(xué)通路發(fā)生了顯著變化。作者使用 R 軟件包 "UpSetR "研究了與 KEGG 通路相關(guān)的模塊（圖 3C）。"表皮發(fā)育"、"角質(zhì)化 "和 "皮膚發(fā)育 "是Top3富集的通路（圖3D）。

圖3 差異表達(dá) FRGs 的 GSEA 富集分析

4. 對差異表達(dá)的 FRGs 進(jìn)行 PPI 分析

為了更好地闡明差異表達(dá)基因之間的相互作用，作者使用 STRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析（圖 4A）。然后，作者應(yīng)用 Cytoscape 的兩個插件 MCODE 和 CytoHubba 篩選基因（圖 4B、C）。兩種結(jié)果交集后，10 個差異表達(dá)的 FRGs 被確定為關(guān)鍵基因（圖 4D）。

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的建立和中心基因的鑒定(A) PPI 網(wǎng)絡(luò)

5. DN 診斷生物標(biāo)志物的鑒定和評估

利用 LASSO 回歸和 SVM-RFE 篩選關(guān)鍵基因，以確定 DN 的診斷生物標(biāo)志物。通過 LASSO 回歸得到了六個重要變量（圖 5A、B）。利用 SVM-RFE 算法得到了八個特征（圖 5C）。將這兩種方法得到的結(jié)果相交后，得到了六個重疊的中心基因（圖 5D）。這六個中心基因分別是 TP53、RB1、NF2、RRM2、PRDX1 和 CDC25A。圖 5E 顯示了這六個中心基因的評估結(jié)果，TP53、RB1、NF2、RRM2、PRDX1 和 CDC25A 的 AUC 值分別為 0.751、0.705、0.725、0.882、0.691 和 0.675。最后，作者將這六個基因確定為 DN 的鐵突變相關(guān)診斷生物標(biāo)志物。TP53、RB1、NF2、RRM2、PRDX1 和 CDC25A 被建立為 DN 的診斷模型。利用 ROC 曲線對診斷模型進(jìn)行了評估，訓(xùn)練集的 AUC 值為 0.939（95% CI：0.863-0.993），驗證集的 AUC 值為 1.000（95% CI：1.000-1.000）（圖 5F、G）。

圖5 DN 生物標(biāo)志物的鑒定和評估

6.DN 診斷生物標(biāo)志物與浸潤免疫細(xì)胞的關(guān)聯(lián)

研究檢查了對照組和 DN 樣本中浸潤的免疫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞存在顯著差異（圖 6A、B）。接下來，作者研究了 DN 樣本中免疫細(xì)胞浸潤與 TP53、RB1、NF2、RRM2、PRDX1 和 CDC25A 的關(guān)系（圖 6C）。

圖6 免疫細(xì)胞浸潤評估

7.這六種生物標(biāo)記物的表達(dá)與驗證

方框圖用于直觀顯示訓(xùn)練集中這六種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。圖 7A-F 顯示，與對照組相比，DN 組中 TP53、RB1、NF2、RRM2 和 PRDX1 的表達(dá)水平顯著增加。相反，DN 組 CDC25A 的表達(dá)水平明顯下降。為了驗證結(jié)果，作者通過 qRT-PCR 檢測了它們在人體正常腎組織和 DN 組織中的表達(dá)水平。圖 7G 中顯示的結(jié)果與訓(xùn)練集中的結(jié)果一致。

圖7 這六種診斷標(biāo)記物的表達(dá)和驗證

8.TP53 通過 PI3K-AKT 信號通路促進(jìn) DN 細(xì)胞凋亡

TP53 是 DN 診斷指標(biāo)中折疊變化差異最大的基因。因此，作者接下來探討了 TP53 對 DN 的影響。通過 Western 印跡分析確定 PI3K-AKT 信號通路中信號蛋白的表達(dá)，包括 PI3K、AKT、p-AKT、mTOR 和 p-mTOR。結(jié)果表明，與對照組和 DN 組相比，si-TP53 組和 DN + si-TP53 組的 PI3K-AKT 信號通路分別被激活（圖 8A）。此外，與 DN 組相比，si-TP53 可顯著增加 c-PARP 和 c-Case-3 的表達(dá)（圖 8B）。作者使用 LY294002 進(jìn)一步抑制了 PI3K-AKT 信號通路，觀察到與 DN 組相比，細(xì)胞凋亡受到明顯抑制。然而，si-TP53 逆轉(zhuǎn)了 DN-si-TP53 + LY294002 組的細(xì)胞凋亡過程（圖 8C）。

圖8 TP53 通過 PI3K-AKT 信號通路促進(jìn) DN

總結(jié)

總之，作者利用生物信息學(xué)工具分析了 GEO 數(shù)據(jù)庫中的 DN 數(shù)據(jù)，從而發(fā)現(xiàn)了 DN 中與鐵突變相關(guān)的潛在分子靶標(biāo)。此外，作者還建立了一個與鐵突變相關(guān)的 6 個基因模型，該模型對 DN 具有極佳的預(yù)測性能。最后，qPCR 和 Western 印跡分析證實，TP53 通過 PI3K-Akt 通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致 DN。