讀完它，

你做WB就NB了。

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Western Blot，簡(jiǎn)稱為WB，中文一般稱為蛋白質(zhì)印跡。WB是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法，其基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況。

蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者一般認(rèn)為是美國(guó)斯坦福大學(xué)的喬治·斯塔克（George?Stark）。在尼爾·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化學(xué)》（Analytical Biochemistry）中首次被稱為Western Blot。

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Western Blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)明者

喬治·斯塔克（George?Stark）

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?Western Blot與Southern印跡雜交或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。

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值得一提的是

Western Blot 這個(gè)名稱的由來(lái)很有意思，最開始做印跡工作的是一個(gè)叫做Southern的科學(xué)家，但印跡的對(duì)象是DNA鏈，他把這種技術(shù)稱為Southern Blot，后來(lái)類似地出現(xiàn)了兩個(gè)過(guò)程相似但對(duì)象不同的印跡方法，一個(gè)是基因組一個(gè)就是蛋白質(zhì)印跡，人們就把名字定為Northern和Western，這已經(jīng)與這兩個(gè)技術(shù)的發(fā)明人沒有關(guān)系了。

Western Blot分為四個(gè)基本的步驟：

樣品制備

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電泳

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印跡

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免疫檢測(cè)

AtaGenix對(duì)Western Blot的四個(gè)步驟中常見的問(wèn)題進(jìn)行了歸類：

1

樣品制備

（1）如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多。目前市面上有專門針對(duì)亞細(xì)胞組分的蛋白抽提試劑盒，可以高效地富集到活性蛋白。

（2）組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性。

2

電泳

（1）條帶呈笑臉狀(︶)：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。

（2）條帶呈皺眉狀(︵)：遷移過(guò)快，電泳系統(tǒng)溫度偏高。

（3）拖尾：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者凝膠兩邊聚合不完全。

（4）紋理（縱向條紋）：樣品溶解不好，樣品中含有不溶性顆粒，電泳前將樣品離心去除顆粒。

（5）條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。

（6）條帶兩邊擴(kuò)散：加樣量過(guò)多。

3

電泳轉(zhuǎn)移

（1）大分子量蛋白的轉(zhuǎn)移效率低？

• 優(yōu)化轉(zhuǎn)移緩沖液

  轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇，甲醇可以降低蛋白的洗脫效率，增加蛋白和膜的結(jié)合能力；

  ?轉(zhuǎn)移緩沖液中加入終濃度0.1% SDS。

• 提高轉(zhuǎn)移電壓/電流。

• 增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。

• 選擇優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜。

（2）膜、濾紙、膠大小有何講究？

濾紙的長(zhǎng)寬分別比膠小1-2 mm，而膜的長(zhǎng)寬分別比膠大1-2 mm。

絕對(duì)禁忌：上下兩層濾紙因?yàn)檫^(guò)大而相互接觸，這樣會(huì)導(dǎo)致短路。

4

免疫檢測(cè)

（1）Western blot結(jié)果中背景高且不均勻?

• 抗體濃度太高：一抗或二抗?jié)舛忍邥?huì)導(dǎo)致高背景，可增加抗體稀釋倍數(shù)。

• 一抗孵育的溫度偏高：建議4℃結(jié)合過(guò)夜。

• 使用的封閉液不兼容：對(duì)比不同的封閉緩沖液。

• 非特異性位點(diǎn)封閉不足：優(yōu)化封閉緩沖液，最好的封閉緩沖液具有系統(tǒng)依賴性。

• 提高封閉液中蛋白的濃度；優(yōu)化封閉時(shí)間和/或溫度，室溫封閉至少1 h或者4°C封閉過(guò)夜。

• 在封閉液中加入Tween-20（終濃度為0.05%）。

• 封閉液中與其他蛋白發(fā)生抗體的交叉反應(yīng)：換一種不同的封閉液；不要用含抗生素蛋白的牛奶封閉，牛奶含生物素。

  交叉反應(yīng)的檢測(cè)：封閉一張干凈的膜，與抗體一起孵育，然后用超感應(yīng)化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)。

• 洗膜不充分：降低HRP結(jié)合物的濃度；增加洗滌次數(shù)和洗膜緩沖液的體積。

• 如果洗滌液中無(wú)Tween-20，添加Tween-20使其終濃度為0.05%。

• 膜在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中干過(guò)：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意保持膜的濕潤(rùn)。

• 選擇的膜容易產(chǎn)生高背景：一般硝酸纖維素膜（NC）的背景會(huì)比PVDF膜低。

• 膜的曝光時(shí)間過(guò)久：縮短印跡膜曝光到膠片的時(shí)間；在孵育過(guò)程中始終進(jìn)行震蕩。

• 膜被污染：小心夾膜——損壞膜可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合；不能空手持膜，始終戴干凈手套或用鑷子。

• 緩沖液污染或結(jié)塊沉淀：制備新的緩沖液。

• HRP處產(chǎn)生聚集體：用0.2 μm過(guò)濾器過(guò)濾結(jié)合物。

• 結(jié)合可產(chǎn)生斑點(diǎn)：用一種新的高質(zhì)量的結(jié)合物。

• 緩沖液中有污染：緩沖液使用前過(guò)濾或使用新的緩沖液。

• 操作設(shè)備被污染：保證電泳儀器、印跡儀器和孵育用容器清潔，無(wú)外源污染物。

• 保證在轉(zhuǎn)膜后沒有凝膠留在膜上（蛋白可能黏在膠上導(dǎo)致背景）。

（2）Western blot結(jié)果中信號(hào)弱或無(wú)信號(hào)？

• 蛋白未轉(zhuǎn)到膜上：

  轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用總蛋白染色劑染膠來(lái)確定轉(zhuǎn)膜效率（總蛋白染色劑可能檢測(cè)不到低量的抗原）；

  確保轉(zhuǎn)膜過(guò)程中膠與膜完全接觸；

  確保轉(zhuǎn)印夾層排布正確；

  確保按照膜的制造商的使用說(shuō)明潤(rùn)濕膜；

  確保轉(zhuǎn)印部件在電印跡過(guò)程中未過(guò)熱；

  使用正對(duì)照和/或分子量Marker；

  可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過(guò)頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流。

• 蛋白未完全結(jié)合到膜上：在轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入20%的甲醇促進(jìn)結(jié)合。低分子量的抗原可能會(huì)穿過(guò)轉(zhuǎn)印膜，需使用小孔徑的膜進(jìn)行。

• 一抗、二抗等不匹配：訂購(gòu)試劑時(shí)認(rèn)真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物；通過(guò)設(shè)置內(nèi)參可驗(yàn)證二級(jí)檢測(cè)系統(tǒng)的有效性。

• 一抗或/和二抗?jié)舛鹊停涸黾涌贵w濃度；延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間；抗體與靶蛋白的親和力可能很?。豢贵w可能失活，可用斑點(diǎn)印跡檢測(cè)其活性。

• 一抗或/和二抗?jié)舛忍撸菏褂锰嘁豢够蚨箍赡軐?dǎo)致底物迅速耗竭，呈現(xiàn)出很弱的信號(hào)，應(yīng)至少成倍稀釋一抗/二抗（可4-10倍）。

• 一抗失效：使用有效期內(nèi)的抗體，分裝保存，避免反復(fù)凍融取用，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

• 過(guò)度封閉：使用含0.5%脫脂奶粉或無(wú)脫脂奶的抗體稀釋液；試用不同的封閉液；減少封閉時(shí)間。

• 洗膜過(guò)度：洗膜時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，加入的去垢劑不宜過(guò)強(qiáng)或過(guò)多，建議使用0.05%的弱去垢劑Tween-20。

• 緩沖液中含有疊氮鈉：疊氮鈉是一種HRP的抑制劑，緩沖液不能使用疊氮鈉作為防腐劑。

• 曝光時(shí)間太短：延長(zhǎng)膠片的曝光時(shí)間，超感應(yīng)化學(xué)發(fā)光底物會(huì)持續(xù)發(fā)光至少6個(gè)小時(shí)。

• 底物孵育時(shí)間太短：在使用超感應(yīng)底物時(shí)需進(jìn)行5分鐘的底物孵育。

• 酶或底物失活：超感應(yīng)化學(xué)發(fā)光底物和超感應(yīng)west膜室溫狀態(tài)下化學(xué)底物可保存至少12個(gè)月，超感應(yīng)免疫膜化學(xué)發(fā)光底物可保存至少6個(gè)月。

  ＊為衡量底物的活性，準(zhǔn)備一個(gè)小量的工作液在一個(gè)暗室內(nèi)，加入少量的HRP結(jié)合物，會(huì)觀察到綠光。如果未檢測(cè)到光，底物或HRP結(jié)合物均有可能失活。

  確保兩底物無(wú)交叉污染，兩種底物試劑的污染可能導(dǎo)致活性下降。

• 膜可以修復(fù)剝離，重新用探針檢測(cè)，在膜剝離過(guò)程中可能會(huì)有抗原損失或變性：優(yōu)化剝離程序；如有必要可重新用探針檢測(cè)；避免在同一張膜上重復(fù)進(jìn)行探針檢測(cè)。

• 抗原在膜上消解：封閉底物（如明膠）可能含有蛋白水解酶活性。

• 印跡膜保存時(shí)蛋白降解：準(zhǔn)備一張新的印跡膜。

（3）Western blot結(jié)果中雜帶較多或特異性條帶位置不對(duì)？

• 細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多，使其蛋白表達(dá)模式分化：使用原始或傳代少的細(xì)胞株或進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。

• 體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有多種修飾形式：乙?；?、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等，本身可以呈現(xiàn)多條帶：查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過(guò)去修飾確定蛋白實(shí)際大小。

• 目的蛋白有其他剪切本：查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析可能性。

• 樣本處理過(guò)程中目的蛋白發(fā)生降解：使用新鮮制備的標(biāo)本并使用蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作。

• 上樣量過(guò)高，太敏感：適當(dāng)減少上樣量。

• 一抗不純：使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶。

• 一抗或者二抗?jié)舛绕撸航档涂贵w濃度，增加二抗對(duì)照；選擇特異性更強(qiáng)，只針對(duì)重鏈的二抗。

• 一抗特異性不高：重新選擇或制備高特異性的抗體。

• 蛋白存在二聚體或多聚體：SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10 min，以增強(qiáng)蛋白質(zhì)解聚變性。

（4）其他現(xiàn)象

• 膜上多處出現(xiàn)黑點(diǎn)或黑斑：可能是由于轉(zhuǎn)膜時(shí)有氣泡或抗體分布不均，抗體與封閉劑結(jié)合，應(yīng)盡量去除氣泡，抗體孵育時(shí)保持搖動(dòng)，過(guò)濾封閉劑。

• 反白（條帶顯白色）：可能是由于HRP結(jié)合物濃度過(guò)高，應(yīng)至少成倍(可4~10倍)稀釋一抗/二抗。

• 靶蛋白分子量偏低或偏高：可能是由于SDS-PAGE膠濃度選擇不合適，應(yīng)調(diào)整膠濃度，分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠。

實(shí)驗(yàn)成功的理由都是一樣的，

失敗的原因卻千差萬(wàn)別。

如果還有什么問(wèn)題

是AtaGenix沒總結(jié)到的，

歡迎各位客官在評(píng)論區(qū)補(bǔ)充。