我們經(jīng)常聽(tīng)到這樣一句話

“失去了才知道珍惜”。

其實(shí)，

只是因?yàn)槭チ瞬胖浪卸嗪谩?/p>

生物學(xué)家也利用這種方法來(lái)研究基因的功能，

美其名曰

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基因敲除

基因敲除(Gene Knockout)是上世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一種新型遺傳工程基因修飾技術(shù)，可針對(duì)某個(gè)特定基因進(jìn)行改造，令其功能喪失，并研究其對(duì)相關(guān)生命現(xiàn)象造成的影響，從而推測(cè)該基因的生物學(xué)功能。

經(jīng)過(guò)近30年的發(fā)展，

目前已經(jīng)出現(xiàn)了很多前沿技術(shù)。

當(dāng)然，

最經(jīng)典的就數(shù)

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同源重組基因敲除技術(shù)

細(xì)胞染色體DNA能夠和外源DNA發(fā)生重組，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，可達(dá)到基因敲除的目的。

主要步驟：

構(gòu)建基因敲除重組載體

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重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞

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篩選成功重組的細(xì)胞

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后續(xù)檢測(cè)

但它的缺點(diǎn)也很明顯

1. 速度慢，效率低（DNA的同源重組頻率一般只有10-6左右）：加長(zhǎng)兩端的同源序列有助于重組，但加大了構(gòu)建基因敲除載體的難度。該技術(shù)主要通過(guò)大量培養(yǎng)來(lái)增加獲得敲除轉(zhuǎn)化子的概率。

2. 載體轉(zhuǎn)化和表達(dá)比較關(guān)鍵，周期較長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞感受態(tài)要求也較高。

3. 對(duì)于真核生物的同源重組基因敲除研究較少：真核生物轉(zhuǎn)化不容易，表達(dá)周期長(zhǎng)，基因調(diào)控復(fù)雜，敲除之后不一定出現(xiàn)特定表型。

?另外，也有一些在同源重組基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)

Red同源重組系統(tǒng)

Red同源重組系統(tǒng)主要包含3種蛋白質(zhì)分子，分別稱為Exo、Beta和Gam，這三者是λ噬菌體中的高效重組蛋白質(zhì)。其中Exo蛋白是一種核酸外切酶，結(jié)合在雙鏈DNA的末端，從5'端向3'端降解DNA，產(chǎn)生3'突出端；Beta蛋白結(jié)合在單鏈DNA上，介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA退火，Gam蛋白可與RecBCD酶結(jié)合，抑制其降解外源DNA的活性。

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Red同源重組技術(shù)具有同源序列短（40-60?bp）、重組效率高等特點(diǎn)。采用該轉(zhuǎn)化體系時(shí)，可在宿主的任意靶位點(diǎn)進(jìn)行基因敲除、敲入和點(diǎn)突變等操作，目前該方法在大腸桿菌中的應(yīng)用已經(jīng)十分成熟。

此外，還有RecA重組敲除系統(tǒng)（由RecA和RecBCD蛋白組成，在基因敲除時(shí)必須以環(huán)狀質(zhì)粒存在）、結(jié)合轉(zhuǎn)化敲除系統(tǒng)及溫度敏感型質(zhì)粒敲除系統(tǒng)等可供選擇。

FLP-FRT系統(tǒng)和Cre-loxP系統(tǒng)

這兩個(gè)系統(tǒng)都是位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)，其中FLP-FRT源于釀酒酵母，Cre-loxP源于F1噬菌體。兩個(gè)系統(tǒng)的基本原理類似。以Cre-loxP系統(tǒng)為例，該系統(tǒng)含有兩種成分：第一個(gè)部分是一段長(zhǎng)34 bp的重組酶識(shí)別的DNA序列（loxP），其中含有兩個(gè)13 bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8 bp的核心序列；第二個(gè)是Cre重組酶，可以引發(fā)loxP位點(diǎn)的DNA重組。當(dāng)靶基因位于兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間時(shí)，在Cre重組酶的作用下，如果兩個(gè)loxP位點(diǎn)的方向相同，則靶基因被敲除；如果兩個(gè)loxP位點(diǎn)的方向相反，則靶基因的方向發(fā)生倒轉(zhuǎn)。

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該系統(tǒng)有諸多優(yōu)點(diǎn)：重組酶（FLP/Cre）與具有特定識(shí)別位點(diǎn)（FRT/loxP）的DNA片斷形成復(fù)合物后，可以直接引發(fā)之后的DNA重組，無(wú)需細(xì)胞或者生物體提供其他的輔助因子；特定識(shí)別位點(diǎn)（FRT/loxP）的DNA序列容易合成；重組酶（FLP/Cre）的編碼基因可以置于多種啟動(dòng)子的調(diào)控之下，從而使這種重組酶在生物體的不同細(xì)胞、組織、器官以及不同發(fā)育階段或不同的生理?xiàng)l件下都能產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮作用，達(dá)到條件性或誘導(dǎo)性基因敲除。

?基因捕獲技術(shù)

基因捕獲（Gene Trap）是功能基因組學(xué)的研究方法，應(yīng)用于表達(dá)基因的尋找。

其原理主要是：

利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除。基因捕獲載體中包括一個(gè)無(wú)啟動(dòng)子的報(bào)道基因，只有轉(zhuǎn)化到有啟動(dòng)子的（能夠表達(dá)的）DNA序列上，才能夠表達(dá)報(bào)告基因。結(jié)合cDNA文庫(kù)和DNA芯片，由此便可以報(bào)告一個(gè)功能基因的位置。因此，基因捕獲也可以當(dāng)做基因敲除文庫(kù)來(lái)使用?，F(xiàn)在已經(jīng)得到了基因捕獲體系的大腸桿菌文庫(kù)，可以進(jìn)行很多細(xì)菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和分析。

基因捕獲的優(yōu)缺點(diǎn)是并存的

優(yōu)點(diǎn)：用常規(guī)方法進(jìn)行基因敲除研究需耗費(fèi)大量的時(shí)間和人力，研究者必須針對(duì)靶位點(diǎn)在染色體組文庫(kù)中篩選相關(guān)的染色體組克隆，繪制相應(yīng)的物理圖譜，構(gòu)建特異性基因敲除載體及篩選靶細(xì)胞等，而利用基因捕獲能夠節(jié)省大量篩選染色體組文庫(kù)以及構(gòu)建特異打靶載體的工作及費(fèi)用，能更有效和迅速地進(jìn)行染色體組的功能分析。

缺點(diǎn)：一是它只能夠敲除表達(dá)的基因，難以對(duì)深入的調(diào)控問(wèn)題做研究。二是無(wú)法對(duì)基因進(jìn)行精細(xì)的遺傳修飾。

再來(lái)看一下

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反義RNA和RNAi技術(shù)

反義RNA是指與mRNA互補(bǔ)的RNA分子，也包括與其他RNA互補(bǔ)的RNA分子。由于核糖體不能翻譯雙鏈的RNA，所以反義RNA與mRNA特異性地互補(bǔ)結(jié)合, 即抑制了該mRNA的翻譯。

根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將其分為3類：

Ⅰ類反義RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶 Ⅲ 降解；

Ⅱ類反義RNA與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象變化，抑制翻譯；

Ⅲ類反義RNA則直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。

雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后，能夠在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，而另一方面雙鏈RNA還能在特定聚合酶下形成單鏈，并和某些蛋白形成復(fù)合物使mRNA被RNA酶裂解，并且以siRNA作為引物，以mRNA為模板形成雙鏈RNA。最后形成siRNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，顯著增加對(duì)基因表達(dá)的抑制。

RNAi敲除主要流程

調(diào)研目的基因的mRNA序列

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設(shè)計(jì)DNA片段編碼反義RNA

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利用基因重組構(gòu)建人工表達(dá)載體

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載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，表達(dá)反義RNA

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篩選表型和后續(xù)基因功能研究

RNAi基因敲除沒(méi)有對(duì)原來(lái)的基因做出改動(dòng)，因而目的基因在細(xì)胞內(nèi)是完好存在的，并且RNAi現(xiàn)象普遍，在幾乎所有真核生物中都能發(fā)揮作用。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基因功能探索和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療。

優(yōu)點(diǎn)

• 比用同源重組法更加簡(jiǎn)便，縮短周期。

• 對(duì)于一些敲除后外培養(yǎng)的細(xì)胞，利用RNAi技術(shù)研究它們的功能。

• 由于RNAi能高效特異地阻斷基因的表達(dá)，因此是研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的良好工具。

• 容易調(diào)控，可用來(lái)研究生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起作用的基因。

缺點(diǎn)

• 序列必須已知，反義DNA必須人工合成，并且序列的選擇原則尚不清楚。

• 目前siRNA導(dǎo)入胞內(nèi)的效率低下，如何有效將siRNA轉(zhuǎn)移入體內(nèi)成為RNAi應(yīng)用的最大障礙。

• 基因沉默的時(shí)效性和遺漏，尤其在多基因家族中的非特異性問(wèn)題尚未得到解決。

• 目前RNAi 機(jī)制尚未完全闡明，因此需要更加深入的研究。

還有

ZFNs技術(shù)和TALEN技術(shù)

ZFNs（鋅指核糖核酸酶）是由一個(gè)DNA識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。DNA 識(shí)別域是由3-6個(gè)Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯(lián)組成，每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基，形成α-β-β二級(jí)結(jié)構(gòu)。其中α螺旋的16氨基酸殘基決定鋅指的DNA結(jié)合特異性，骨架結(jié)構(gòu)保守。對(duì)決定DNA結(jié)合特異性的氨基酸引入序列的改變可以獲得新的DNA結(jié)合特異性。根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)8-10個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域并與FokⅠ核酸內(nèi)切酶結(jié)合可構(gòu)成靶向特定位點(diǎn)的ZFNs，在FokⅠ切割域的二聚化作用下完成對(duì)目的基因的編輯。

TALEs蛋白包括三部分：N端序列、C端序列、由高度保守的重復(fù)單元組成的中心重復(fù)區(qū)。每個(gè)重復(fù)單元中除12、13位氨基酸（repeat varible di-residues，RVDs）可變外其余幾乎相同，RVD與A、T、C、G之間有著嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即NI-A；NG-T；HD-C；NN-G。構(gòu)建TALE時(shí)，根據(jù)靶DNA序列變換RVDs并串聯(lián)重復(fù)單元并與FokI切割結(jié)構(gòu)域結(jié)合。TALE與靶位點(diǎn)結(jié)合，二聚化的FokI對(duì)其進(jìn)行切割，完成基因編輯操作。

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優(yōu)點(diǎn)和局限

ZFN?能夠識(shí)別并結(jié)合指定的基因序列位點(diǎn)，并高效精確地切斷。隨后細(xì)胞利用天然的 DNA 修復(fù)過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn) DNA 的插入、刪除和修改。這項(xiàng)技術(shù)中設(shè)計(jì)特異性的ZFN是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，可結(jié)合計(jì)算生物學(xué)方法設(shè)計(jì)高特異性的ZFN，但面臨的挑戰(zhàn)是難以完全找到匹配的3聯(lián)子鋅指，并且脫靶效應(yīng)（Off-target）嚴(yán)重。

TALE的DNA結(jié)合域中重復(fù)氨基酸序列模塊可以與單堿基發(fā)生特異性結(jié)合，TALEN 技術(shù)能夠克服ZFN方法不能識(shí)別任意目標(biāo)基因序列以及識(shí)別序列經(jīng)常受上下游序列影響等問(wèn)題，因此靈活性更好，并且基因操作簡(jiǎn)單方便，但脫靶效應(yīng)同樣嚴(yán)重。

更有興起不久的

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CRISPR/Cas9系統(tǒng)

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas( CRISPR-associated)?系統(tǒng)是一種廣泛存在于細(xì)菌與古細(xì)菌中，由RNA介導(dǎo)的可遺傳獲得性免疫系統(tǒng)。它能夠?yàn)樗拗骷?xì)胞提供對(duì)外源DNA（如噬菌體質(zhì)粒）的免疫功能。在此基礎(chǔ)上建立起來(lái)的CRISPR/Cas9 基因敲除系統(tǒng)目前廣泛應(yīng)用于原核生物、釀酒酵母、線蟲(chóng)、斑馬魚及哺乳動(dòng)物中。

工作原理

crRNA(CRISPR-derived RNA）通過(guò)堿基配對(duì)與tracrRNA(trans-activating RNA)結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，引導(dǎo)核酸酶 Cas9蛋白在與crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。細(xì)胞通過(guò)自身的同源重組或者非同源重組機(jī)制修復(fù)受損的雙鏈DNA，從而達(dá)到基因敲除的目的。研究者通過(guò)改造形成更加簡(jiǎn)潔的具有引導(dǎo)作用的sgRNA（short guide RNA），也能夠引導(dǎo)Cas9對(duì)DNA的定點(diǎn)切割。?

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主要流程

尋找靶基因中合適的gRNA序列

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設(shè)計(jì)單鏈oligo序列，退火形成雙鏈DNA

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利用基因重組將雙鏈連到表達(dá)載體

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載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞

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篩選陽(yáng)性克隆

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gRNA引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行剪切

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克隆子測(cè)序驗(yàn)證

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篩選表型和后續(xù)基因功能研究

sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)址大奉送

http://spot.colorado.edu/slin/cas9.html
http://www.ecrisp.org/E‐CRISP/;
http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx
http://crispr.mit.edu/?
http://tools.genome-engineering.org

http://cas9.cbi.pku.edu.cn/

http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR

http://crispr-era.stanford.edu/

https://crispr.bme.gatech.edu/

寫在最后

基因敲除技術(shù)在生命科學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域中應(yīng)用非常廣泛，并且在不斷發(fā)展和完善中，最終目的是讓靶基因的表達(dá)降為零。這可以通過(guò)基因表達(dá)調(diào)控的多個(gè)層面進(jìn)行，如基因的轉(zhuǎn)錄、終止、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯、翻譯后調(diào)控、酶活性調(diào)控等。

現(xiàn)階段的基因敲除技術(shù)主要建立在基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯等層次并始終面臨著巨大困難，其原因有二：

• 基因有著復(fù)雜的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制，生物體中很多基因行使著相同的功能，敲除一個(gè)功能基因后并不一定能夠引起明顯的改變和出現(xiàn)容易識(shí)別的表型（曾報(bào)道過(guò)將酵母菌40%的基因沉默掉，它仍能夠正常生長(zhǎng)）。

• 另一方面，對(duì)于某些必需基因或看家基因（House-keeping Gene），敲除后會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)或造成細(xì)胞的死亡，導(dǎo)致無(wú)法對(duì)這些基因進(jìn)行相應(yīng)的研究。

因此，

基因敲除技術(shù)

始終伴隨著其他相關(guān)技術(shù)前進(jìn)著，

在生命知識(shí)揭示和發(fā)現(xiàn)過(guò)程中

起著舉足輕重的作用。