前言

2022年10月31日，南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科和臨床研究中心團(tuán)隊(duì)于Cell Death Discovery ( IF 6.350 )上在線發(fā)表了解析膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)替莫唑胺(TMZ)耐藥機(jī)制的最新研究進(jìn)展。作者利用家小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物通過連續(xù)植入MGMT -高甲基化U87細(xì)胞構(gòu)建了異種腫瘤移植模型，并分別使用低濃度的生理鹽水和TMZ對模型進(jìn)行連續(xù)治療和腫瘤傳代得到TMZ-S和獲得性TMZ-R的GBM細(xì)胞。通過功能實(shí)驗(yàn)和單細(xì)胞測序進(jìn)一步對TMZ-S和獲得性TMZ-R的GBM細(xì)胞進(jìn)行了差異解析，這將有助于揭示膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的替莫唑酰胺耐受機(jī)制并為臨床腫瘤治療提供新的思路。

歐易生物對該項(xiàng)目的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序實(shí)驗(yàn)和分析工作提供了支持，單細(xì)胞測序結(jié)果揭示了TMZ-S和獲得性TMZ-R的細(xì)胞異質(zhì)性，并挖掘到了TMZ-R細(xì)胞群中一個特定的腫瘤干細(xì)胞亞群，為獲得性TMZ-R的耐藥機(jī)制提供了研究新思路。接下來，我們具體解析一下該項(xiàng)目的研究思路和實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

基本信息

期刊：Cell Death Discovery

影響因子：6.350?

發(fā)表年月：2022年10月

材料：The human GBM cell line U87，腹部被注射了U87的BALB/c雄性裸鼠，兩天一次連續(xù)14天給予生理鹽水的腹部腫瘤小鼠（TMZ-S），兩天一次連續(xù)14天給予替莫唑胺的腹部腫瘤小鼠（TMZ-R），注射TMZ治療的TMZ-S和TMZ-R小鼠（TMZ-S+TMZ/TMZ-R+TMZ)

方法：10x Genomics高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

研究背景

惡性腦膠質(zhì)瘤是成年人中最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)瘤。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma multiforme, GBM），以下稱為GBM，是最易發(fā)生、來勢最兇猛的一種原發(fā)腦瘤?，F(xiàn)有的GBM常規(guī)治療方案主要有手術(shù)、放射治療和替莫唑胺（temozolomide，TMZ）給藥輔助性化學(xué)治療。替莫唑胺(TMZ)是一種口服烷基化劑，其細(xì)胞毒性是通過將DNA的O6鳥嘌呤甲基化為O6甲基鳥嘌呤進(jìn)而誘導(dǎo)DNA交聯(lián)實(shí)現(xiàn)的，最終將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。MGMT，O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶（O6-Alkylguanine-DNA alkyltransferase），對TMZ造成的腫瘤基因的損傷可進(jìn)行直接修復(fù)，阻礙了TMZ化療烷化劑對腫瘤細(xì)胞的殺傷，MGMT的活性和腫瘤的TMZ耐藥性呈很強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系。MGMT在組織中的表達(dá)與其啟動子甲基化狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)，MGMT基因啟動子區(qū)域被甲基化會造成MGMT基因的沉寂，從而降低MGMT對TMZ化療的抑制。臨床研究發(fā)現(xiàn)，與非甲基化的病人相比，MGMT基因啟動子甲基化的病人在TMZ治療過程中會取得更好的治療結(jié)果。

盡管TMZ治療與MGMT基因啟動子的甲基化和MGMT的表達(dá)有密切相關(guān)，但現(xiàn)有證據(jù)表明，在GBM進(jìn)展和TMZ治療期間，MGMT啟動子甲基化狀態(tài)和MGMT蛋白都保持相對穩(wěn)定，同時MGMT-null GBM患者對TMZ的獲得性耐藥不太可能與MGMT的高表達(dá)相關(guān)，這意味著可能存在與MGMT無關(guān)的耐藥機(jī)制。

為了揭示TMZ獲得性耐藥的機(jī)制，作者對小鼠進(jìn)行了U87細(xì)胞(一種TMZ- null GBM細(xì)胞系)異種移植，通過三個周期的TMZ治療和體內(nèi)腫瘤傳代，構(gòu)建了獲得性TMZ-耐藥(TMZ- R)模型，通過單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)分析持續(xù)TMZ治療導(dǎo)致的細(xì)胞異質(zhì)性，進(jìn)一步闡明MGMT-null GBM患者產(chǎn)生TMZ-R耐藥的原因，為細(xì)胞克服TMZ耐藥性，恢復(fù)治療反應(yīng)提供良好的解決方案。

研究結(jié)果

Result1 獲得性抗TMZ（TMZ-R) GBM異種移植模型的構(gòu)建與確定

為了構(gòu)建獲得性的TMZ-R的GBM細(xì)胞，作者將U87細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)，并使用低濃度TMZ對小鼠進(jìn)行三個周期的TMZ治療和腫瘤傳代，同時以生理鹽水治療的小鼠作為對照，將從連續(xù)TMZ治療的異種移植組織中分離出抗替莫唑胺的組織或細(xì)胞命名為TMZ- R，從生理鹽水處理的異種移植組織中分離出的命名為TMZ-S(圖1A)。

為了驗(yàn)證所構(gòu)建TMZ-R模型的穩(wěn)定性，作者進(jìn)行了一系列的驗(yàn)證分析實(shí)驗(yàn)，包括生長速度的比較(圖1B)，實(shí)施TMZ治療后各腫瘤細(xì)胞的生長速度比較（圖1C），TMZ-R抗性模型和TMZ-S對照模型對多種抗癌藥物的IC50分析（圖1E)，兩種典型的多藥耐藥相關(guān)蛋白的編碼基因ABCB1 (MDR1)和ABCC3在TMZ-R和TMZ-S細(xì)胞中的表達(dá)水平比較（圖1F），以上實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定了所構(gòu)建的獲得性TMZ-R模型的穩(wěn)定性，表明該模型可產(chǎn)生穩(wěn)定的多藥耐藥衍生原代細(xì)胞以用于后續(xù)分析實(shí)驗(yàn)。

同時，作者利用DOX熒光分子結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)TMZ-R對DOX攝取比TMR-S的攝取量低，表明組織的化學(xué)耐藥性與藥物攝取受損有關(guān)（圖1G)。作者進(jìn)一步分析了TMZ治療對體內(nèi)MGMT表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)TMZ的持續(xù)治療不會減少組織MGMT啟動子的甲基化，這也進(jìn)一步表明MGMT啟動子甲基化/MGMT的高表達(dá)并不是組織產(chǎn)生TMZ抗性的原因。

Result2 獲得性TMZ-R組織中含有更多的靜息態(tài)腫瘤干細(xì)胞

本研究發(fā)現(xiàn)與來自TMZ-S的原代細(xì)胞比，來自TMZ-R的原代細(xì)胞的增殖能力更弱（圖2A, B）。EdU標(biāo)記顯示TMZ-R腫瘤細(xì)胞中的DNA復(fù)制進(jìn)程顯著減慢，且TMZ-R細(xì)胞中G0/G1細(xì)胞的比例顯著增加（圖2C,D,E），表明TMZ-R存在細(xì)胞周期阻滯。

通過比較腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133陽性(CD133+)細(xì)胞的數(shù)量和經(jīng)典神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)譜，證實(shí)了TMZ持續(xù)化療會驅(qū)動組織干細(xì)胞的擴(kuò)展（圖2F,G）。在細(xì)胞三維球形培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中作者發(fā)現(xiàn)來自TMZ-R衍生的腫瘤干細(xì)胞 CSCs球擴(kuò)增能力顯著降低(圖2I,H)，同時人類腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki67在TMZ-R的CSCs中的表達(dá)也顯著降低，在細(xì)胞中的分布也更稀疏(圖2J,K）,說明TMZ-R衍生出了更多處于靜息態(tài)的腫瘤干細(xì)胞。

處于細(xì)胞周期阻滯的靜息態(tài)腫瘤干細(xì)胞不僅可以躲過阻止細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的腫瘤治療手段，還會通過休眠產(chǎn)生耐藥性，這被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因。

Result3? 通過scRNA-seq鑒定了TMZ-R組織中的一個腫瘤干細(xì)胞亞群

作者對從TMZ-S和TMZ-R組織中分離出的樣本進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序，在TMZ-S細(xì)胞文庫中，捕獲到18894個細(xì)胞，每個細(xì)胞平均有2776個基因。在TMZ-R細(xì)胞文庫中，捕獲到8627個細(xì)胞，每個細(xì)胞平均有3669個基因，這表明TMZ-R中的細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生了明顯改變。

通過降維聚類，TMZ-R分成了11個不同的細(xì)胞群，TMZ-S分成了12個不同的細(xì)胞群。為了進(jìn)一步探索耐藥細(xì)胞的異質(zhì)性和演化過程，作者進(jìn)行了擬時序分析，與TMZ-S相比，TMZ-R衍生細(xì)胞的重建軌跡顯示出更多的分支(圖3A)。應(yīng)用基因集變異分析(GSVA)，作者對TMZ-R聚類的11個細(xì)胞群按照GO-BP進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)有6個細(xì)胞群與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表達(dá)相關(guān)的基因上調(diào)，在這6個群中，C0、C2、C7對藥物反應(yīng)的相關(guān)基因下調(diào)且對ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)相關(guān)的基因上調(diào)(圖B)，與此同時，TMZ-S的10個細(xì)胞群中只有C8對藥物反應(yīng)下調(diào)，C5對轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)上調(diào)，說明TMZ-R有著更低的藥物反應(yīng)和更強(qiáng)的藥物排出能力，進(jìn)一步解釋了TMZ-R對藥物的不敏感現(xiàn)象。

作者后續(xù)對TMZ-R中的C0、C2和C7集中進(jìn)行了細(xì)胞鑒定。作者從人類細(xì)胞圖譜數(shù)據(jù)庫和現(xiàn)有文獻(xiàn)中篩選了若干個人類腦癌干細(xì)胞標(biāo)記物作為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR，在TMZ-R中篩選出表達(dá)上調(diào)的8個腦癌干細(xì)胞標(biāo)記物，包括PROM1 (CD133)、SOX2、NES (Nestin)和CD44(補(bǔ)充圖6)，其中NES (Nestin)、SOX2和CADM1在C0、C2和C7中顯著富集（圖3C）。

結(jié)合LOUPE發(fā)現(xiàn)在TMZ-R中NES 、SOX2和CADM1三個基因同時富集在了一個特定亞群，鑒定到了來自TMZ-R腫瘤的三陽性(SOX2+/CADM1+/NES+) CSC亞群(圖3D)，結(jié)合mIHC/IF染色，未在TMZ-S細(xì)胞中觀察到三陽性細(xì)胞，進(jìn)一步表明三陽性(SOX2+/CADM1+/NES+) CSC亞群是TMZ-R特有的(圖3H, I)。進(jìn)一步通過擬時序分析發(fā)現(xiàn)SOX2、CADM1和NES三陽性細(xì)胞在假定時間內(nèi)的末端積累，以此推測TMZ的重復(fù)治療會誘導(dǎo)細(xì)胞去分化（圖3F)。在此基礎(chǔ)上，作者結(jié)合GSVA評價三陽性細(xì)胞(SOX2+/CADM1+/NES+)和非三陽性細(xì)胞亞組的藥物反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)三陽性細(xì)胞對藥物反應(yīng)顯著下調(diào)，這可能與其ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體活性增強(qiáng)有關(guān)(圖3G)。

以上，通過單細(xì)胞測序分析揭示了持續(xù)的TMZ治療誘導(dǎo)了細(xì)胞的多樣性分化，并產(chǎn)生了一個獨(dú)特的三陽性(SOX2+/CADM1+/NES+)腫瘤干細(xì)胞亞群，其對藥物反應(yīng)顯著降低，這是TMZ-R細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的主要原因。

Result4? EGFR在特定的腫瘤干細(xì)胞亞群中的表達(dá)量顯著降低

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們了解到TMZ-R細(xì)胞有著相對較弱的增殖狀態(tài)，同時衍生的CSCs大多處于靜止?fàn)顟B(tài)，這暗示了TMZ-R干細(xì)胞培養(yǎng)基對營養(yǎng)因子的低響應(yīng)。考慮到EGFR負(fù)責(zé)CSCs的維持和自我更新，作者推測TMZ-R衍生的CSCs可能只表達(dá)了少量的EGFR。通過LOUPE確定了EGFR在TMZ-R的分布較TMZ-S明顯減少（圖4A），同時TMZ-R中表達(dá)EGFR的細(xì)胞數(shù)量明顯少于TMZ-S(圖4B-D)，Western blot試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了TMZ-R腫瘤中EGFR的整體下調(diào)(圖4E)。作者進(jìn)一步檢測了TMZ-R腫瘤的三陽性細(xì)胞中EGFR的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)三陽性細(xì)胞的EGFR表達(dá)水平明顯低于非三陽性細(xì)胞(圖4F-J)。

綜上所述，EGFR的缺乏是TMZ-R細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)的基礎(chǔ)，且EGFR在三陽性腫瘤干細(xì)胞中顯著缺乏。

Result5? EGFR缺乏將導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞CSCs細(xì)胞周期阻滯，可作為抗化療耐藥靶標(biāo)

TMZ-R腫瘤來源的CSCs雖然僅表達(dá)少量EGFR，但仍能響應(yīng)EGF的刺激產(chǎn)生應(yīng)答(圖5A)，在EGF持續(xù)刺激下，TMZ-R腫瘤來源的CSCs的增殖能力得到了恢復(fù)(圖5B-D)，表明EGF促進(jìn)了TMZ-R細(xì)胞恢復(fù)自我更新能力并誘導(dǎo)了細(xì)胞周期阻滯中靜止細(xì)胞的釋放。

作者進(jìn)一步探索了EGF刺激是否有助于提高TMZ-R對藥物的化學(xué)敏感性。IC50試驗(yàn)表明EGF處理提高了TMZ-R細(xì)胞對藥物的化療敏感性(圖5E)，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步表明EGF處理能增強(qiáng)TMZ-R細(xì)胞對藥物的吸收(圖5F)。

基于以上的體外研究結(jié)果，作者通過對TMZ- R細(xì)胞異種移植模型采用TMZ和EGF聯(lián)合治療，確定EGF克服體內(nèi)耐藥的可行性。從腫瘤生長曲線(圖5G)和最后一天采集的腫瘤的重量測定(圖5H)結(jié)果可看出，單獨(dú)使用EGF不會改變腫瘤的生長能力，但EGF+TMZ的聯(lián)合治療能顯著抑制腫瘤生長。

綜上所述，本研究揭示了EGF的持續(xù)刺激能激活TMZ-R細(xì)胞恢復(fù)自我增殖，提高TMZ- R對腫瘤藥物的敏感性。

研究結(jié)論

替莫唑胺(TMZ)耐藥是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)治療的主要臨床挑戰(zhàn)，然而耐藥細(xì)胞的進(jìn)化過程尚不清楚，因此，解析細(xì)胞產(chǎn)生獲得性耐藥特性的機(jī)制對腫瘤的臨床治療尤為重要。在此研究中，作者構(gòu)建了一個獲得性TMZ耐藥（TMZ-R）的異種移植模型，通過單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)發(fā)現(xiàn)了在TMZ持續(xù)治療下，通過強(qiáng)制表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(nanog, Sox2和Nestin)，TMZ- R產(chǎn)生了細(xì)胞異質(zhì)性，部分細(xì)胞系重編程形成了腫瘤干細(xì)胞，且大量的腫瘤干細(xì)胞存在細(xì)胞周期阻滯，處于靜止?fàn)顟B(tài)?；诤罄m(xù)的單細(xì)胞測序分析在TMZ-R的CSCs中鑒定到了一個表達(dá)NES+/Sox2+/ CADM1+三陽性特征的CSCs，其表現(xiàn)出顯著的耐藥優(yōu)勢，這些具有耐藥性的靜息態(tài)腫瘤干細(xì)胞可能是獲得性TMZ-R的GBM患者產(chǎn)生耐藥的原因。進(jìn)一步研究表明，表皮生長因子受體(EGFR)的缺乏和下游信號的減弱可能是導(dǎo)致三陽性CSCs具有耐藥優(yōu)勢的主要原因，利用EGF進(jìn)行持續(xù)治療能機(jī)械逆轉(zhuǎn)細(xì)胞周期阻滯，提高TMZ-R細(xì)胞對TMZ的化學(xué)敏感性，應(yīng)用EGF+TMZ的聯(lián)合治療能使機(jī)體產(chǎn)生良好的TMZ藥物反應(yīng)。

綜上，作者發(fā)現(xiàn)在MGMT缺失的生物環(huán)境中，EFGR活性的降低可能會引起腫瘤干細(xì)胞進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)，使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤獲得TMZ耐藥特性。因此，在低MGMT表達(dá)或MGMT啟動子高甲基化的患者中，EGFR信號的恢復(fù)可能會重新編程TMZ-R細(xì)胞，恢復(fù)患者的化療敏感性。本研究揭示了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的替莫唑酰胺耐受機(jī)制并為腫瘤治療提供了新的思路。

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