自CRISPR系統(tǒng)的基因編輯潛力開發(fā)起，于2013年開始實(shí)踐以來，它們已從根本上改變了我們操縱基因敲除的能力，并已在世界各地的實(shí)驗(yàn)室中得到廣泛應(yīng)用。當(dāng)這種基因編輯能力與干細(xì)胞的增殖潛能結(jié)合在一起時(shí)，科學(xué)家們就提高了他們對細(xì)胞生物學(xué)，人類遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)以及再生醫(yī)學(xué)的未來潛能的發(fā)展理解。

由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，下一代基因組測序和干細(xì)胞技術(shù)的成熟，它們的組合使用的可能性也得到了啟發(fā)。以下是這個(gè)快速發(fā)展領(lǐng)域中的最新進(jìn)展，以展示在基因編輯（例如基因敲除，基因敲入和點(diǎn)突變等）干細(xì)胞研究的交叉領(lǐng)域中有突破的最新進(jìn)展。

修飾特定基因的能力為表征基因的強(qiáng)大功能，進(jìn)行了基因治療，糾正了特定基因突變，根除疾病，工程細(xì)胞和生物體以實(shí)現(xiàn)更多創(chuàng)新功能并獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為疾病的研究模型提供了強(qiáng)大的工具。簇狀規(guī)則間隔的技術(shù)繁瑣序列CRISPR/Cas9技術(shù)徹底改變了基因組工程。 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在干細(xì)胞研究中的應(yīng)用使研究人員能夠開發(fā)新的疾病模型，以探索新的治療工具并解決退行性疾病。此外，關(guān)于使用CRISPR/Cas9作為新醫(yī)學(xué)療法發(fā)明中的有用技術(shù)存在挑戰(zhàn)和未來前景。

1，使用CRISPR/Cas9創(chuàng)建對抗IL-1- /TNF-α介導(dǎo)的炎癥和干細(xì)胞

為了創(chuàng)建能夠可以自動(dòng)調(diào)節(jié)干細(xì)胞或原代細(xì)胞，為對抗頑強(qiáng)的IL-1和TNF-α介導(dǎo)的炎癥和干細(xì)胞，研究人員應(yīng)用了基因組編輯系統(tǒng)CRISPR/Cas9。編碼螢火蟲熒光素酶轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因或細(xì)胞因子拮抗劑的轉(zhuǎn)基因，無論是鼠IL-1Ra還是嵌合人sTNFR1-鼠免疫球蛋白G（Bloquel等，2004），都被靶向了鼠iPSCs細(xì)胞中的Ccl2起始密碼子Diekman等，2004年使用CRISPR/Cas9平臺(tái)。

結(jié)果表明，基因組工程可以成功地應(yīng)用于內(nèi)源性細(xì)胞回路的重新連接，以實(shí)現(xiàn)炎癥介質(zhì)及其拮抗劑之間規(guī)定的輸入/輸出關(guān)系。這為通過快速響應(yīng)的自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)進(jìn)行基于細(xì)胞的藥物遞送或基于細(xì)胞的疫苗奠定了基礎(chǔ)。干細(xì)胞中固有的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的定制，也為多種疾病提供了更有效的治療方法，創(chuàng)新了思路。

2，在多能或多能干細(xì)胞的遺傳修飾中使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)

結(jié)合干細(xì)胞的多能性，該技術(shù)代表了一種強(qiáng)大的工具，可以生成用于疾病建模，藥物篩選，毒理學(xué)和靶向療法的各種細(xì)胞類型。通常，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已應(yīng)用于多能或多能干細(xì)胞的遺傳修飾，之后將細(xì)胞分化為特定的細(xì)胞類型，并用于功能分析或臨床移植。CRISPR/Cas9技術(shù)的最新進(jìn)展擴(kuò)大了干細(xì)胞研究及其治療應(yīng)用的范圍。這篇文章綜合概述了CRISPR/Cas9技術(shù)的當(dāng)前應(yīng)用和前景，特別是在干細(xì)胞研究和治療方面。

3，結(jié)合iPSC和CRISPR/Cas9技術(shù)研究遺傳性疾病的分子和細(xì)胞機(jī)制

在與mRNA水平控制基因的RNAi相反，CRISPRi允許在轉(zhuǎn)錄水平抑制基因。這使研究人員能夠抑制干細(xì)胞中的某些基因并破譯其功能。 Kampmann解釋說：“對于CRISPRi，我們將轉(zhuǎn)錄阻遏域（KRAB域）靶向基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以抑制其表達(dá)。這種敲除方法非常有效，并且缺乏基于RNAi的基因敲除的臭名昭著的脫靶效應(yīng)使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)（例如基因敲除，基因敲除和點(diǎn)突變等）介導(dǎo)iPSC干細(xì)胞有助于研究遺傳性疾病的機(jī)制，包括免疫，代謝，血液，神經(jīng)退行性疾病和心臟病。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細(xì)胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

源井生物根據(jù)客戶需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個(gè)基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。