2021年10月18號，來自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)寄生蟲課題組王春仁團(tuán)隊在Front Cell Infect Microbiol雜志上在線發(fā)表了題為“Identification of Myoferlin, a Potential Serodiagnostic Antigen of Clonorchiasis, Immunoproteomic Analysis of Sera From Different Infection Periods and Excretory-Secretory Products of?Clonorchis sinensis”的研究論文。華支睪吸蟲病是由華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis）引起的一種重要的食源性疾病。該研究采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法?（LC-MS/MS）進(jìn)行了免疫共沉淀（Co-IP）分析（青蓮百奧提供技術(shù)支持），以探究C. sinensis的排泄分泌產(chǎn)物（ESP）作為病原體在宿主-寄生蟲相互作用中發(fā)揮的重要作用。

華支睪吸蟲是一種重要的食源性病原體。它主要影響哺乳動物，如狗、貓和人類，其典型的臨床癥狀包括黃疸、膽管炎和膽道梗阻。華支睪吸蟲病還與肝纖維化、其他人類肝膽疾病和膽管癌（CCA）密切相關(guān)。因此，在該研究中，分別在感染后7天、14天、35天和77天收集感染華支睪吸蟲的兔血清和華支睪吸蟲成蟲，并進(jìn)行免疫共沉淀（Co-IP）實驗同時結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）對免疫復(fù)合物進(jìn)行評估和表征。該研究的目的是確定ESP中敏感性和特異性的抗原靶點，并為華支睪吸蟲病提供更多潛在的診斷靶點。

實驗結(jié)果

C. Sinensis?ESP蛋白檢測

C.?sinensis成蟲的ESP中大部分蛋白的分子量為10~170ku，共檢測到334個蛋白，其中有注釋信息的蛋白為254個。

不同感染時期與兔血清互作的C. sinensis?ESP蛋白檢測

使用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)方法來鑒定C. sinensis分泌的蛋白質(zhì)，特別是使用感染血清拉下來可能參與宿主-寄生蟲相互作用的C. sinensis?ESP。Co-IP結(jié)果顯示，第7、14、35?和77天血清中的抗體可以識別并拉下來自C. sinensis?ESP?的特定蛋白，并且大多數(shù)蛋白的分子量范圍為15至170 ku。LC-MS/MS結(jié)果顯示，5種蛋白只能在早期（7天）檢測到，這可能解釋了它們在宿主中誘導(dǎo)了早期反應(yīng)，并且發(fā)現(xiàn)3種蛋白在四個時期都特異性的表達(dá)，包括動力蛋白輕鏈1（dynein light chain-1）、動力蛋白輕鏈2（dynein light chain-2）和myoferlin蛋白，這三種蛋白參與機(jī)體運(yùn)動和能量代謝，在不同階段均表現(xiàn)出高表達(dá)，從而為C. sinensis提供能量。

互作蛋白的KEGG信號通路分析

挑選了在C. sinensis中檢測到，但在F. livera和S. japonicum中未檢測到的27種參與宿主-寄生蟲相互作用的蛋白。KEGG分析顯示，這些蛋白主要參與氧化磷酸化、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等途徑。并且每個感染時期的蛋白豐度不同，cystoskeleton、氧化磷酸化和mRNA surveillance pathway相關(guān)蛋白在感染早期（7天）高表達(dá)，可能參與早期免疫逃避。在寄生蟲感染中期（14天），膜運(yùn)輸相關(guān)蛋白明顯增加，可能在為寄生蟲提供能量方面發(fā)揮重要作用。NOD-like受體信號通路、谷胱甘肽代謝和溶酶體相關(guān)蛋白在感染晚期（35天和77天）高表達(dá)；C. sinensis分泌的溶酶體可以有效滅活宿主釋放的蛋白質(zhì)以保護(hù)自身。

重組蛋白的基因克隆及抗原性分析

為了獲得更好的表達(dá)，根據(jù)生物信息學(xué)提供的抗原表位，將myoferlin蛋白截斷為兩部分（Myof1和Myof2）。利用特異性寡核苷酸引物擴(kuò)增Myof1和Myof2（1500bp和810bp）基因，并將其克隆到大腸桿菌pET32a表達(dá)載體中。克隆的Myof1和Myof2在大腸桿菌BL21細(xì)胞中成功表達(dá)。對重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，分子量約為60ku（Myof1）和31ku（Myof2）。該蛋白在C. sinensis感染兔的血清可進(jìn)行不同水平的檢測，而在S. japonica和F. hepatica感染兔的血清中未檢測出，說明myoferlin蛋白可能是檢測華支睪吸蟲病的潛在抗原。

小結(jié)?

華支睪吸蟲病是一種食源性吸蟲病，在中國、韓國和越南等地區(qū)備受關(guān)注。流行病學(xué)和實驗研究報道，華支睪吸蟲感染可誘發(fā)膽管上皮增生、膽管纖維化、膽管囊變，也可能促進(jìn)膽管癌的發(fā)生。C. sinensis不斷地從排泄口向外界釋放ESP（蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)等復(fù)雜混合物），暴露于ESP的細(xì)胞會產(chǎn)生多種病理生理反應(yīng)，包括增殖、凋亡、氧化還原穩(wěn)態(tài)破壞和炎癥等。因此，鑒定ESP中蛋白組成對于我們了解寄生蟲誘導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。結(jié)果表明，該研究使用的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)方法可能對華支睪吸蟲病的血清抗原診斷具有重要作用。此外，myoferlin蛋白可能作為華支睪吸蟲病免疫學(xué)診斷的潛在biomarker。

華支睪吸蟲不同感染時期的血清和排泄-分泌產(chǎn)物的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)分析

期刊名稱：Front Cell Infect Microbiol

影響因子：4.123

樣本選擇：

感染華支睪吸蟲后7天、14天、35天和77天的兔血清和對照兔血清樣本；

F.?livera和S. japonicum感染的陽性兔血清（用于對照的病原菌）；

從感染兔的膽管中分離華支睪吸蟲成蟲提取ESP蛋白。

技術(shù)策略：免疫蛋白質(zhì)組學(xué)（CoIP-MS）

編輯：簡爽

校稿：楊云飛

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