前言

臨床上，B系和T系急性淋巴細胞白血?。˙/T-ALL）的常規(guī)治療策略為聯(lián)合化療，雖然近年來嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）療法取得了顯著效果，但部分ALL仍呈難治性，而且治療后復(fù)發(fā)的風(fēng)險較高，5年生存率僅為68.8%左右。研究發(fā)現(xiàn)，ALL治療耐受的原因或可系抗白血病宿主免疫所致，其中抗白血病自然殺傷（NK）細胞扮演了重要角色。作為效應(yīng)細胞毒性淋巴細胞，NK細胞較CAR-T細胞有著多種先天優(yōu)勢，或可成為免疫細胞療法的熱門研究對象。

為了進一步發(fā)展基于NK細胞的ALL治療方案，來自美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Caroline Duault 、Anil Kumar教授課題組在Blood期刊（IF：25.476）發(fā)表了題為 的研究成果，通過流式細胞術(shù)研究方法，比較了健康人群與B/T-ALL患者的NK細胞在免疫表型和功能性上的差異。發(fā)現(xiàn)了NK細胞分析作為預(yù)測急性淋巴細胞白血病患者臨床結(jié)果的診斷工具的好處，并強調(diào)了同種異體NK細胞輸注預(yù)防急性淋巴細胞復(fù)發(fā)的臨床潛力。

研究思路

研究結(jié)果

1.NK細胞頻率和細胞毒性在B / T-ALL患者中降低

通過比較了B / T-ALL患者和健康供體之間CD56NK細胞的頻率，在控制CD14或CD33骨髓細胞，CD3T / NK T細胞以及CD19或CD20 B細胞后。與小鼠ALL中報告的NK細胞數(shù)量減少一致，與健康供體相比，ALL患者的非惡性免疫部分內(nèi)的NK細胞頻率顯著降低（圖1A-B）?；颊吆徒】倒w之間NK細胞活力和增殖的差異不存在，表明B / T-ALL中的NK細胞頻率可能由其他機制降低。

圖1 | NK 細胞頻率和細胞毒性在高風(fēng)險 B/T-ALL 患者中降低

2.具有細胞毒性較小的CD56分子特征的NK細胞在B / T-ALL中擴增

所有 NK 細胞的細胞毒性降低表明，所有患者中細胞溶解性 NK 效應(yīng)細胞的產(chǎn)生均受干擾。因此，作者假設(shè)CD56和CD56的NK細胞的頻率在ALL中受到干擾。

使用CIBERSORT，作者將NK細胞的相對頻率與CD56和CD56暗的分子特征進行比較。在診斷時測量來自COG和MILE的患者樣本的轉(zhuǎn)錄組。與急性淋巴細胞毒性降低的急性淋巴細胞毒性一致，作者發(fā)現(xiàn)具有CD56光分子特征的NK細胞的頻率增加，而具有CD56暗特征的NK細胞的頻率降低，在B / T-ALL中（圖2B）。

圖2 | 具有細胞毒性較小的CD56分子特征的NK細胞在B / T-ALL中擴增

所與健康供體相比，來自B / T-ALL患者的PBMC中的CD56和CD56NK細胞頻率保持不變，盡管CIBERSORT顯示具有CD56NK細胞轉(zhuǎn)錄組的細胞在ALL中富集（圖2B）。CD27和CD56的共表達表明，大多數(shù)CD56NK細胞是CD27，分化成CD56細胞毒性效應(yīng)子導(dǎo)致CD27丟失。作者發(fā)現(xiàn)患者中細胞毒性最低的CD56CD27 ?NK細胞分?jǐn)?shù)顯著增加，并且BMMC中細胞毒性CD56dimCD27?NK細胞亞群隨之減少，但在PBMC中則不然（圖2C-F）。

BMMCs中未成熟CD56CD27和CD27 NKp46 NK細胞的增加證實了所有患者中細胞毒性較小的CD56NK細胞的擴增（圖2C-D;補充圖5A-B，6A，C）。對于PBMC，盡管所有NK細胞中的CD56，CD27或NKp46沒有擾動（圖2E-F;補充圖5C-D和6B，D），但作者觀察到NK細胞的細胞毒性降低，并且具有CD56轉(zhuǎn)錄組的NK細胞被富集（圖1C-D，2B）。因此，作者推斷來自急性淋巴細胞（ALL）患者的PBMC中的NK細胞表現(xiàn)出CD56特征。

3.NK細胞成熟為細胞毒性效應(yīng)子在B / T-ALL患者的PBMC中受到干擾

B / T-ALL患者中細胞毒性最強的CD56dimCD94低亞群的頻率顯著降低（圖3A-B）。抑制性受體 KIR2DL1（CD56NK 細胞比 CD56 NK 細胞表達更多）在總細胞中也減少，CD56 在所有 NK 細胞中也減少（圖 3C-D）。研究數(shù)據(jù)表明，產(chǎn)生細胞毒性NK效應(yīng)細胞的途徑在急性淋巴細胞中受到干擾。NK效應(yīng)器成熟是一個4階段的過程。

最后，比較所有患者和健康供體中細胞毒性誘導(dǎo)激活受體DNAM-1的表達，與健康供體相比，患者DNAM-1總NK細胞減少的趨勢，細胞毒性最強的CD56dimDNAM1 NK細胞的頻率顯著降低，以及CD56dimDNAM-1-細胞毒性部分增加的趨勢（圖3G-H）。由于CD56dimDNAM-1NK細胞是細胞毒性最大的NK細胞部分，研究結(jié)果表明，急性淋巴細胞白血病患者的NK細胞成熟缺陷。從CD56到CD56NK亞群的NK效應(yīng)器成熟中的擾動導(dǎo)致B / T-ALL患者中功能失調(diào)的NK細胞的積累。

圖3 | NK細胞成熟為細胞毒性效應(yīng)子在B / T-ALL患者的PBMC中受到干擾

4.受刺激的所有NK細胞比健康細胞產(chǎn)生更多的細胞因子

CD56NK細胞在用PMA離子霉素或單因子刺激時，表達比CD56對應(yīng)物更高水平的細胞因子干擾素-γ（IFN-γ），腫瘤壞死因子（TNF）和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）。由于CD56狀NK細胞在B / T-ALL中增加（圖2和3），作者預(yù)測受刺激的所有NK細胞將產(chǎn)生比正常對應(yīng)物更多的細胞因子。因此，作者比較了B / T-ALL患者和健康對照組中表達細胞內(nèi)細胞因子的PMA 離子霉素刺激的NK細胞亞群的頻率。作者發(fā)現(xiàn)，與健康供體相比，B/T-ALL患者的BMMC和PBMC中GM-CSF和TNF-αNK細胞的頻率增加。與健康個體相比，B / T-ALL患者的IFN-γNK細胞在PBMC中顯著增加，但在BMMC中保持不變（圖4）。在急性淋巴細胞白血病患者中，PBMC 和 BMMC 的 CD56 NK 細胞部分中，MIP-1β和白細胞介素-2 （IL-2） 細胞分別顯著增加。因此，受刺激的所有NK細胞比其健康細胞產(chǎn)生更多的細胞因子，進一步證實了所有患者中未成熟，產(chǎn)生細胞因子和細胞毒性差的CD56狀NK細胞的擴增。

圖4 | B / T-ALL患者中受刺激的NK細胞比健康患者產(chǎn)生更多的細胞因子。

5.過度活化和疲憊的NK細胞積聚在急性淋巴細胞白血病患者的外周血中

研究發(fā)現(xiàn)與健康供體相比，ALL患者的受刺激PBMC NK細胞部分的CD107a 細胞顯著增加，證實了ALL中CD56明亮狀NK細胞的富集。細胞因子，裂解顆粒和CD107a的表達增加（圖4）表明急性淋巴細胞白血病患者的PBMC NK細胞過度活化。通過流式細胞術(shù)比較ALL患者和健康供體的NK細胞中活化標(biāo)志物CD6978和Ca2動員水平，作者觀察到所有患者的總NK細胞和NK細胞亞群中CD69?細胞顯著增加（圖5A-B），并發(fā)現(xiàn)所有NK細胞表現(xiàn)出更高的鈣通量（圖5C-D）。因此，所有NK細胞都比健康的NK細胞更活躍。

圖5 | 過度活化和疲憊的NK細胞積聚在急性淋巴細胞白血患者的外周血中

6.高頻率的活化NK細胞預(yù)示著高風(fēng)險B-ALL的臨床預(yù)后較差

通過分析中樞神經(jīng)系統(tǒng) （CNS）受累（CNS?、CNS2 或 CNS3）的預(yù)后不良的 B-ALL，作者發(fā)現(xiàn)激活的 NK 細胞頻率越高，RFS 越短（圖 6C）。然后，作者研究了在誘導(dǎo)治療結(jié)束時（第29天）根據(jù)最小殘留疾?。∕RD）分類為MRD?或MRD的患者，活化和靜息NK細胞的頻率是否可以獨立預(yù)測患者的臨床結(jié)果。作者觀察到，在預(yù)后較差的MRD?和預(yù)后較好的MRD患者中，激活的NK細胞的相對比例越高，預(yù)后越大的NK細胞相對比例越高，預(yù)后越大，結(jié)果越差，RFS就越短（圖6D）。

將僅活化NK細胞和沒有靜息NK細胞（100%活化NK，n = 85）的患者與沒有活化NK細胞且僅靜息NK細胞（100%靜息NK，n = 73）的患者進行比較，作者發(fā)現(xiàn)100%活化NK細胞的患者預(yù)后比100%靜息NK細胞的患者更差（圖6E）。最后，作者發(fā)現(xiàn)，活化的NK細胞的缺失獨立地預(yù)測了B-ALL患者的CNS ?，MRD和MRD?患者的有利臨床結(jié)果（圖6F-G）。因此，活化的NK細胞分子特征的富集預(yù)示著急性淋巴細胞的臨床結(jié)局較差，這與CNS受累或MRD狀態(tài)無關(guān)。

圖6 | 高頻率的活化NK細胞預(yù)示著高風(fēng)險B-ALL的臨床預(yù)后較差

7.CD56、CD69、鈣信號傳導(dǎo)和細胞因子在預(yù)后不良的所有患者中均增加

實驗證實，僅活化NK細胞的COG B-ALL患者表達更高水平的NK細胞活化標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)與100%靜息NK細胞和更好預(yù)后的對應(yīng)物相比，ALL中的NK細胞活化標(biāo)志物水平更高。100%活化NK細胞患者的CD56和CD69轉(zhuǎn)錄本顯著增加于100%靜息NK細胞的患者，使用基因集富集分析，研究表明Ca2信號傳導(dǎo)在100%活化的NK細胞組中顯著上調(diào)。因此，具有100%活化NK細胞的所有患者的預(yù)后不佳可能源于未成熟的慢性活化NK細胞反復(fù)失敗以裂解淋巴細胞（圖3-5）。

由于所有NK細胞在刺激時都可以產(chǎn)生更多的細胞因子（圖4），假設(shè)GM-CSF，TNF和IFN-γ的高表達與CIBERSORT中活化的NK細胞的分子特征一致。為了測試這一點：

（1）研究比較了具有100%活化NK細胞或100%靜息NK細胞的COG B-ALL患者中轉(zhuǎn)基因腦脊液/ CSF2，TNF-β / LTA，TNF-C / LTB和IFN-γ / IFNG的轉(zhuǎn)錄本水平。由于TNF-α的表達在COG中不可用，使用TNF-β和TNF-C，它們也在受刺激的CD56NK細胞中誘導(dǎo)。在100%活化的NK細胞與100%靜息NK細胞的患者中，GM-CSF和TNF信使RNA顯著增加，并且IFN-γ增加的趨勢（圖7A）。

（2）根據(jù)轉(zhuǎn)基因腦脊液、TNF和IFN-γ的中位信使RNA表達，將COG B-ALL患者分為2組，如GM-CSF高TNF高IFN-γ高（n = 22）和GM-CSF低TNF低IFN-γ低（n = 19），并使用CIBERSORT估計這些組中活化和靜息NK細胞的相對頻率。GM-CSF高TNF高IFN-γ高組的患者活化NK細胞的頻率高于GM-CSF低TNF低IFN-γ低組（圖7B）。因此，CIBERSORT中活化的NK細胞的分子特征與經(jīng)典的NK細胞活化標(biāo)志物一致，包括細胞因子的產(chǎn)生增加。

圖7 | 產(chǎn)生細胞因子的 NK 細胞的高頻預(yù)示著急性淋巴細胞的嚴(yán)重程度增加和預(yù)后較差

相關(guān)討論

研究表明，NK細胞促進骨髓移植受者ALL的消退強調(diào)了NK細胞在抗白血病免疫監(jiān)測中的作用。然而，NK細胞監(jiān)測在人類急性淋巴細胞白血病中受到干擾的機制，以及NK細胞監(jiān)測中的這些擾動是否預(yù)測了患者的臨床結(jié)果，都是未知的。研究表明，急性淋巴細胞白血病患者中細胞毒性NK效應(yīng)細胞的產(chǎn)生減少可能會降低NK細胞的細胞毒性。

研究發(fā)現(xiàn)具有臨床相關(guān)性;過度激活的產(chǎn)生細胞因子的 NK 細胞預(yù)示著 B/T-ALL 患者的不良結(jié)局，與預(yù)后因素（包括 MRD 和中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累）無關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)，激活的產(chǎn)生細胞因子的NK細胞預(yù)示著兒童和成人急性淋巴細胞白血病的臨床結(jié)果不佳。作者預(yù)計將將作者的研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為基于流式細胞術(shù)的血液或骨髓抽吸物NK細胞分析，以預(yù)測所有患者在診斷時的結(jié)果，并確定可以從NK細胞療法中受益的患者。

研究結(jié)論

B 細胞和 T 細胞急性淋巴細胞白血病 （B/T-ALL） 可能在治療后通過抑制由自然殺傷 （NK） 細胞特異性介導(dǎo)的宿主抗癌免疫監(jiān)測而變得難治或復(fù)發(fā)。使用質(zhì)譜細胞術(shù)、流式細胞術(shù)和計算機細胞術(shù)描繪了B/T-ALL高?；颊咧蠳K細胞的表型和功能缺陷，進一步闡明了NK細胞在維持急性淋巴細胞白血病（ALL）消退中的作用。與正常細胞相比，來自B / T-ALL患者的NK細胞毒性較小，但表現(xiàn)出以高CD56，高CD69，活性NK細胞起源細胞因子的產(chǎn)生和鈣（Ca2 +）信號傳導(dǎo)為特征的活化特征。因此，NK細胞的缺陷成熟成細胞毒性效應(yīng)子可以防止來自ALL的NK細胞像正常NK細胞一樣有效地裂解NK細胞敏感靶標(biāo)。此外，ALL中的NK細胞已經(jīng)耗盡，這可能是由它們的慢性活化引起的。產(chǎn)生細胞因子的活化NK細胞頻率增加與疾病嚴(yán)重程度增加有關(guān)，并獨立預(yù)測急性淋巴細胞白血病患者的不良臨床結(jié)局。

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