苜蓿，作為全球最重要的豆科飼用作物，是奶業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，享有“牧草之王”的美譽(yù)。最早可以追溯自2000年前，在漢武帝時(shí)，張騫出使西域，發(fā)現(xiàn)大宛汗血馬喜食苜蓿，就將它的種子帶回關(guān)內(nèi)。唐朝李商隱有詩(shī)云“漢家天馬出蒲梢，苜蓿榴花遍近郊” 。這些是關(guān)于苜蓿使用的最早記載，足以看出古人們對(duì)它的重視。

而如今，苜蓿類植物早已成為人們餐桌上一道別有風(fēng)味的美食，美好的事物總要有好的東西去承載，苜蓿在這千年的歷史長(zhǎng)河里，無(wú)論是作為牧草還是作為餐桌美食的存在都發(fā)揮出了最大的價(jià)值。后人們通過對(duì)苜蓿的研究，給予了這類牧草更多的價(jià)值發(fā)揮空間。
2022年中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)王濤教授、董江麗教授團(tuán)隊(duì)在?Molecular Plant?上發(fā)表了題為“Differentiation trajectories and biofunctions of symbiotic and un-symbiotic fate cells in root nodules of Medicago truncatula”的研究論文。該團(tuán)隊(duì)攻克了分離根瘤單細(xì)胞的技術(shù)難關(guān)，報(bào)道了以截形苜蓿為代表的不定型根瘤單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示了成熟的不定型根瘤中不同轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式的細(xì)胞類群，以及共生細(xì)胞類型和非共生細(xì)胞類型的分化軌跡和生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)了共生固氮新機(jī)制：固氮細(xì)胞將氮同化為谷氨酰胺，非固氮細(xì)胞將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為天冬酰胺供植物生長(zhǎng)發(fā)育的新機(jī)制。本研究中 10x 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由博奧晶典提供。

研究背景

生物固氮是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要方向之一，其中，豆科植物與根瘤菌共生固氮是全球生物固氮總量貢獻(xiàn)最大的模式。根瘤是豆科植物與根瘤菌共生固氮的場(chǎng)所，在這一特殊器官中發(fā)生著復(fù)雜的物質(zhì)、能量、信息交流與轉(zhuǎn)化。根瘤可分為定型根瘤（如大豆、百脈根等）和不定型根瘤（如苜蓿、豌豆等），其中不定型根瘤呈現(xiàn)為棒狀，具有持續(xù)分化的頂端分生組織，空間上從遠(yuǎn)端到近端可分為不同區(qū)域，細(xì)胞類型更加復(fù)雜；然而，不定型根瘤目前尚無(wú)系統(tǒng)性的細(xì)胞類型分析，不同細(xì)胞類型之間的交互和關(guān)聯(lián)也尚不清楚。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1、根瘤原生質(zhì)體制備及 scRNA-seq 測(cè)定分群

研究人員首先優(yōu)化了根瘤原生質(zhì)體裂解和純化的實(shí)驗(yàn)方案，以截形苜蓿 14 dpi的根瘤為樣本，共收集獲得超過 18000 個(gè)根瘤細(xì)胞用于后續(xù)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析。經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，共獲得 9756 個(gè)根瘤細(xì)胞 22228 個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。在無(wú)監(jiān)督分析條件下，根瘤細(xì)胞被分為 13 個(gè)細(xì)胞類群，包括 2 類頂端分生細(xì)胞（NA1 和 NA2），侵染前細(xì)胞（PI），侵染細(xì)胞（IF），2 類固氮細(xì)胞（NF1 和 NF2），根瘤薄壁細(xì)胞（NP），2 類非侵染細(xì)胞（UiC1 和 UiC2），維管相關(guān)細(xì)胞（VA），2 類未知功能細(xì)胞（UN1 和 UN2），以及混合無(wú)定義細(xì)胞（MIX）（如圖1）。

為了進(jìn)一步了解這些細(xì)胞簇的特性，作者緊接著將 scRNA-seq 數(shù)據(jù)與根瘤激光捕獲顯微切割技術(shù)（LCM）介導(dǎo)的批量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Bulk RNA-seq）數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記基因的上下調(diào)趨勢(shì)一致，這些數(shù)據(jù)的一致性也表明了作者對(duì)細(xì)胞簇的注釋是非常合適的（如圖2）。

2、構(gòu)建定型根瘤的物理細(xì)胞圖

為了進(jìn)一步研究這些細(xì)胞簇的物理位置，作者利用各個(gè)細(xì)胞類群特異性表達(dá)的標(biāo)記基因構(gòu)建 promoter:GUS 報(bào)告系統(tǒng)，結(jié)果均表明分生細(xì)胞 NA1 和 NA2 主要位于根瘤頂端分生區(qū)，共生類型細(xì)胞中侵染前細(xì)胞 PI 和侵染細(xì)胞 IF 主要位于侵染區(qū)，NF1 主要位于中間區(qū)和固氮區(qū)，NF2 主要位于固氮區(qū)；非共生細(xì)胞類型中薄壁細(xì)胞 NP 主要位于根瘤中央?yún)^(qū)外周尤其是頂端區(qū)域，非侵染細(xì)胞 UiC1 和 UiC2 主要鑲嵌在根瘤中央?yún)^(qū)共生細(xì)胞類型之間，維管相關(guān)細(xì)胞 VA 主要位于外周呈束狀環(huán)抱根瘤中央?yún)^(qū)。

3、共生和非共生細(xì)胞的連續(xù)分化軌跡重建

緊接著，為了進(jìn)一步了解不同的根瘤細(xì)胞群是如何組織和相互連接的，作者進(jìn)行了擬時(shí)序分析。首先使用 Monocle2 算法對(duì)共生和非共生細(xì)胞群進(jìn)行了可視化分析，選取 Na2、PI、IF 和 NF1 分析共生群并指定 Na2 作為擬時(shí)間的開始。緊接著，作者采取 Monocle3 算法進(jìn)行了驗(yàn)證，通過擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)，共生類型細(xì)胞和非共生類型細(xì)胞分別從兩類頂端分生細(xì)胞出發(fā)沿不同的軌跡分化。

4、不同黃酮類化合物的合成和代謝在共生和非共生細(xì)胞中精細(xì)區(qū)域化及功能分析

緊接著，作者對(duì)黃酮類物質(zhì)合成途徑關(guān)鍵基因、氨基酸合成及轉(zhuǎn)運(yùn)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)根瘤細(xì)胞高度異質(zhì)，不同細(xì)胞類群可能承擔(dān)著不同的生物學(xué)功能。尤其是氨基酸合成途徑，氮同化產(chǎn)物谷氨酰胺主要在固氮細(xì)胞 NF2 中合成，而植物利用氮素主要以天冬酰胺形式儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)，天冬酰胺則主要在非侵染細(xì)胞 UiC2 中合成；因此，非侵染細(xì)胞分擔(dān)了根瘤氮同化生產(chǎn)線中的重要一環(huán)。

該研究利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示了不定型根瘤的細(xì)胞異質(zhì)性，為解析豆科植物共生固氮的分子機(jī)制提供了重要的數(shù)據(jù)資源。

參考文獻(xiàn)

Ye Q, Zhu F, Sun F, et al. Differentiation trajectories and biofunctions of symbiotic and un-symbiotic fate cells in root nodules of Medicago truncatula[J].?Molecular Plant,?2022, 15(12): 1852-1867.