在生理條件下，細(xì)胞自噬活性通常較低。但在饑餓、缺氧和疾病等刺激下細(xì)胞自噬活性會顯著上調(diào)。另外，細(xì)胞自噬抑制也與某些疾病相關(guān)，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病和傳染病等。鑒于細(xì)胞自噬與不同的生理和病理生理過程之間存在緊密聯(lián)系，故科學(xué)工作者需要選擇理想的細(xì)胞自噬檢測方法。下面介紹一下基于LC3的細(xì)胞自噬檢測方法：

Western Blot檢測LC3表達(dá)量

利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價細(xì)胞自噬形成。細(xì)胞自噬形成時，胞漿型LC3-I會酶解掉一小段多肽，隨后跟PE結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば偷腖C3-II。因此可以通過LC3-II/I比值的大小估計細(xì)胞自噬水平的高低。

圖1. WB檢測LC3和p62蛋白表達(dá)示意圖

（Yoshii, S.R. and N. Mizushima. Int J Mol Sci, 2017.）

熒光顯微鏡法觀察法

LC3蛋白被募集到自噬體形成綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，因此，可以通過熒光顯微鏡觀察內(nèi)源性LC3或GFP-LC3，即可實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞自噬發(fā)生的檢測。與不存在溶酶體抑制劑時相比，存在溶酶體抑制劑時LC3點(diǎn)狀體數(shù)量的增加代表了在處理期間降解的自噬體數(shù)量。

?圖2.熒光顯微鏡檢測自噬通量示意圖

a組：自噬激活的細(xì)胞，b組：自噬誘導(dǎo)缺陷型細(xì)胞，c組：溶酶體降解不足細(xì)胞

（Yoshii S R , ?Noboru M . International Journal of Molecular ences, 2017.）

GFP-LC3單熒光和mCherry-GFP-LC3雙熒光指示系統(tǒng)

細(xì)胞自噬形成時，GFP-LC3或mCherry-GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)移至細(xì)胞自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色或黃色熒光斑點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞自噬溶酶體形成后，酸性的溶酶體環(huán)境使GFP熒光淬滅，而mCherry熒光不受影響，細(xì)胞自噬溶酶體呈現(xiàn)紅色熒光。因此，可以通過LC3熒光指示系統(tǒng)來監(jiān)測細(xì)胞自噬流。

圖3. LC3細(xì)胞自噬雙標(biāo)系統(tǒng)追蹤細(xì)胞自噬流不同階段
（Hansen T E, Johansen T. BMC Biology, 2011.）

流式細(xì)胞術(shù)測定GFP-LC3的降解

流式細(xì)胞術(shù)是定量測量熒光標(biāo)記蛋白水平的有效工具。自噬小體內(nèi)膜上的LC3在溶酶體中被降解，因此，LC3的整體降解量可以通過GFP-LC3熒光的降低進(jìn)行檢測，是檢測自噬活性的良好指標(biāo)。GFP強(qiáng)度因營養(yǎng)饑餓降低，而自噬或溶酶體抑制劑則增強(qiáng)GFP強(qiáng)度。

圖4. 流式細(xì)胞術(shù)測定GFP-LC3降解示意圖

（Yoshii S R , ?Noboru M . International Journal of Molecular ences, 2017.）