2022?年?7?月，北京大學(xué)第一醫(yī)院普外科楊尹默教授團(tuán)隊(duì)和南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胰腺中心在?Cancer Letters（IF: 9.756） 在線發(fā)表了應(yīng)用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組揭示胰腺癌中 T 細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的 CCL5/SDC1 受體-配體相互作用的文章。本研究中 10x 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序由博奧晶典提供。

【發(fā)表期刊】Cancer Letters

【發(fā)布時(shí)間】2022年7月

【影響因子】9.756

【檢測技術(shù)】scRNA-seq

胰腺導(dǎo)管腺癌 （PDAC） 的腫瘤微環(huán)境（TME）復(fù)雜，由大量的基質(zhì)細(xì)胞組成。其中，腫瘤浸潤性T細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。PDAC 患者對免疫檢查點(diǎn)抑制劑反應(yīng)不佳，可能與免疫抑制的 TME 以及免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用有關(guān)。腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞表達(dá)的CCL5可通過多種途徑促進(jìn)腫瘤發(fā)展，SDC1和SDC4是CCL5的受體，然而，CCL5-SDC1/4相互作用在PDAC的作用仍不清楚。

研究思路

研究結(jié)果

1. PDAC患者樣本的總體情況

對 6 名未接受任何術(shù)前治療的 PDAC 患者的 4 個(gè)腫瘤和 4 個(gè)相鄰的非癌組織進(jìn)行 scRNA-seq。經(jīng)過嚴(yán)格篩選，獲得 38, 260 個(gè)細(xì)胞，鑒定出了 13 種已知的細(xì)胞類型（圖1A-B）。為了揭示 PDAC 中 T 細(xì)胞異質(zhì)性，分離了 T 細(xì)胞并進(jìn)行了單獨(dú)的聚類分析，總共鑒定出 8 種 T 細(xì)胞亞群（圖1D）。小提琴圖展示了不同 T 細(xì)胞亞群的 marker 基因的表達(dá)水平（圖1E），氣泡圖顯示了 FindMakers 函數(shù)生成的前 5 個(gè) T 細(xì)胞亞群特異性基因（圖1F）。

2. PDAC 中 T 細(xì)胞的發(fā)育軌跡

根據(jù) T 細(xì)胞的細(xì)胞類型（圖 2A）、衍生標(biāo)本（圖 2B）和選定基因的表達(dá)水平（圖 2C）進(jìn)行 PDAC 的 T 細(xì)胞發(fā)育軌跡的擬時(shí)序分析，分析結(jié)果展示了兩條發(fā)展路徑，P1：na?ve T ?細(xì)胞到效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞；P2：na?ve T 細(xì)胞到 Tregs。圖 2D 展示了細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變相關(guān)基因的熱圖，這些基因被分為 6 類，其中許多免疫抑制分子，如簇 1 中的TNFRSF18、IL2RA、LAYN、TNFRSF4、TIGIT 和 BATF，從初始 T 細(xì)胞到 Tregs 逐漸增加。此外，RNA 速率分析展示了從幼稚 T 細(xì)胞到效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞或 Tregs 的轉(zhuǎn)錄動力學(xué)（圖 E）。分離 cluster 0 和 cluster 2（幼稚 T 細(xì)胞）和 cluster 1 （Tregs）以鑒定與從幼稚 T 細(xì)胞到 Tregs的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變相關(guān)的潛在基因（圖 F）。Tregs與腫瘤患者的預(yù)后和免疫治療反應(yīng)密切相關(guān)，因此，研究人員比較了不同樣本中 Tregs 的比例，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中 Tregs 的比例明顯高于非癌組織（圖 G）。使用生物信息學(xué)工具進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，即 PDAC 中 Tregs 的比例顯著高于正常胰腺組織（圖 H）。此外，Tregs的 marker 基因 TNFRSF4 在 PDAC 有潛在的預(yù)后價(jià)值，與 TNFRSF4 表達(dá)水平較低的患者相比，TNFRSF4 表達(dá)水平較高的患者具有更好的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）（圖 I–J）。

3. ?PDAC 中導(dǎo)管惡性細(xì)胞的鑒定及其與 T 細(xì)胞的相互作用

分離出導(dǎo)管細(xì)胞構(gòu)建新的基因細(xì)胞矩陣，單獨(dú)進(jìn)行聚類分析，確定了 8 個(gè)Clusters （圖3A）。Clusters 2/3/5/6 的體細(xì)胞大規(guī)模染色體拷貝數(shù)變異（CNV）水平顯著高于對照細(xì)胞（T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞），因此，將 Clusters 2/3/5/6 定義為惡性導(dǎo)管細(xì)胞（圖 3B-C）。小提琴圖顯示不同導(dǎo)管細(xì)胞亞群腫瘤 marker 基因的表達(dá)水平，CEACAM5、TFF1 和 TFF2 在部分腫瘤簇中富集，驗(yàn)證了導(dǎo)管細(xì)胞惡性特性（圖3D） 。在 TME 中，不同細(xì)胞亞群之間存在復(fù)雜的細(xì)胞間通訊，共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，圖? 3E 展示了 PDAC 中腫瘤浸潤 T 細(xì)胞與惡性導(dǎo)管細(xì)胞之間的受體-配體相互作用，結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞和 T 細(xì)胞之間有很強(qiáng)的聯(lián)系，其中T細(xì)胞分泌的趨化因子 CCL5 可以與腫瘤細(xì)胞表面的受體 SDC1 和 SDC4 結(jié)合（圖 3E）。

4. 基于 scRNA-seq 分析 CCL5、SDC1、SDC4 的表達(dá)和分布

為了進(jìn)一步研究 CCL5 和 SDC1/4 的表達(dá)和分布，作者從開放數(shù)據(jù)庫下載多個(gè) PDAC 人和小鼠 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集。圖 4A-B 為不同數(shù)據(jù)集 PDAC 的細(xì)胞圖譜。圖 4C-E 展示了不同數(shù)據(jù)集的不同細(xì)胞類型中 CCL5、SDC1 和 SDC4 的表達(dá)水平，CCL5 在 T 細(xì)胞中特異表達(dá)，導(dǎo)管細(xì)胞較高水平表達(dá) SDC1 和 SDC4。RNA Fish 檢測結(jié)果顯示 CCL5 和 CD3D 在 PDAC 和鄰近的非癌組織中的共定位（圖 5C）。綜上所述，T 細(xì)胞可能分泌趨化因子 CCL5，與 PDAC 中的腫瘤細(xì)胞表面受體 SDC1/4 結(jié)合。

5. PDAC 中的 T 細(xì)胞表達(dá)了豐富的 CCL5

為了更好地描述 PDAC 中腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞群的特征，研究人員獲取了人類和小鼠所有 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集中 PDAC 中 T 細(xì)胞的共同標(biāo)記基因（圖 5A-B）。CCL5 是 T 細(xì)胞常見的標(biāo)記基因之一。RNA Fish 結(jié)果顯示 CCL5 和 CD3D 在 PDAC 和鄰近的非癌組織中的共定位（圖5C）。圖 5D 顯示 CCR1、SDC1、SDC4 在不同細(xì)胞系間的相對表達(dá)，可以發(fā)現(xiàn)包括 PANC-1 在內(nèi)的許多 PDAC 細(xì)胞系，SDC1 和 SDC4 水平高于正常胰管細(xì)胞株（hTERT-HPNE）。PANC- 1 濃度梯度刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CCL5 刺激后，PANC-1 的遷移能力明顯增強(qiáng)（圖 5E-F）。接下來，作者提取了 PANC-1 和 AsPC-1 的 總 ?RNA，與重組 CCL5（2 ng/ml）孵育 24 小時(shí)后進(jìn)行 RNA-seq?；鹕綀D顯示 PBS 組和實(shí)驗(yàn)組之間的差異表達(dá)基因，這些差異表達(dá)基因在細(xì)胞遷移中富集（圖5G-H）。

6. CCL5 通過與 SDC1 相互作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移

接下來，研究人員進(jìn)一步檢測了 CCL5 在腫瘤細(xì)胞遷移中的作用，通過不同濃度梯度的重組人 ?CCL5（2-4 ng/ml）處理后的 PANC-1 和 AsPC-1 與對照組相比，細(xì)胞遷移能力顯著提高（圖6A-D）。為了驗(yàn)證 T 細(xì)胞可能通過體外 CCL5 和 SDC1 的受體-配體相互作用與腫瘤細(xì)胞作用的假設(shè)，作者通過慢病毒載體將 SDC1 的 shRNA 轉(zhuǎn)入 PANC-1。RT-qPCT 和 Western blot 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后，PANC-1 中 SDC1 在轉(zhuǎn)錄本水平以及蛋白水平均顯著下調(diào)（圖6E）。SDC1 的敲除部分降低了 CCL5 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移的能力（圖6G-H）。綜上所述，腫瘤浸潤的 T 細(xì)胞可能通過 CCL5/SDC1 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。

總結(jié)

1. 繪制了 PDAC 的完整細(xì)胞圖譜，推斷了 T 細(xì)胞的發(fā)育軌跡，并鑒定出惡性導(dǎo)管細(xì)胞；

2. 發(fā)現(xiàn) PDAC 中腫瘤浸潤 T 細(xì)胞富集了 CCL5 的表達(dá)；

3. 利用 iTALK 方法觀察到 T 細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的 CCL5-SDC1/4 受體-配體相互作用；

4. 體外證明了 T 細(xì)胞可以通過 CCL5/SDC1 軸促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移，靶向 CCL5/SDC1 軸可能是一種有效的 PDAC 治療方法。

參考文獻(xiàn)

Chen K, Wang Y, Hou Y, Wang Q, Long D, Liu X, Tian X, Yang Y. Single cell RNA-seq reveals the CCL5/SDC1 receptor-ligand interaction between T cells and tumor cells in pancreatic cancer.?Cancer Lett. 2022 Oct 1;545:215834. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215834.