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打敗玄學(xué)，配圖詳解WB實(shí)驗(yàn)翻車的9個(gè)致命傷！

2023-09-12 10:45 作者:南京福麥斯生物 0人讀過 | 我要投稿

Western blot做太多的同學(xué)，通常會(huì)有一種錯(cuò)覺，這不是在做科研，這是在跟玄學(xué)做斗爭！

條帶失蹤、背景漆黑雜帶叢生真是家常便飯了，另外還得到了一個(gè)冷知識(shí)，這世界上最恐怖的笑，莫過于WB沖你邪魅一笑！

針對(duì)高頻WB異常結(jié)果，配圖詳解12個(gè)WB翻車結(jié)果及7個(gè)靈魂提問解答，還有電泳和轉(zhuǎn)印環(huán)節(jié)、跑膠經(jīng)驗(yàn)吐血匯總！這些內(nèi)沒有個(gè)十年腦溢血根本總結(jié)不出來！

在文末也為大家準(zhǔn)備了免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)，包括免疫三劍客WB?/ IHC / ELISA，還有FC / IP /?IF / FC / ChIP，有需要可以文末自行下載！

一、12個(gè)高頻異常結(jié)果

#1?無背景無條帶

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上圖展示一點(diǎn)信號(hào)都沒有，大部分情況是因?yàn)榭贵w加錯(cuò)了。如果中間出現(xiàn)細(xì)微的條帶，可能是蛋白上樣量太少，一抗?jié)舛冗^低，ECL 發(fā)光液失效。

#2 高背景

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高背景是?WB 實(shí)驗(yàn)中最常見的問題，目的條帶單一清晰，但其他地方又彌漫性較均一的背景（比較連續(xù)的）。雜帶多大概率是抗體特異性不好，也有可能抗體濃度太高，可嘗試降低一抗?jié)舛冗M(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

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#3 非特異性條帶

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此種情況絕大多數(shù)是因?yàn)橐豢共缓?，你無法判斷哪一條是目的條帶。如果實(shí)在沒有更好的抗體，建議采用陰性對(duì)照和陽性對(duì)照來確定上述哪個(gè)條帶是目的條帶。當(dāng)然也有一種很小幾率的可能是一抗?jié)舛忍咭鸬姆翘禺愋越Y(jié)合。

#4 條帶中出現(xiàn)邊緣規(guī)則的白圈

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我們常常將電轉(zhuǎn)液倒入一個(gè)盤子里，倒入的液體不宜太多或太少，建議高度與放上第一層濾紙齊平，然后往濾紙上澆點(diǎn)轉(zhuǎn)膜液，往膠上面澆點(diǎn)電轉(zhuǎn)液，用兩只手的拇指和食指輕輕夾住?NC 膜的兩側(cè)中間，使膜成 U 型，然后將 U 型底部接觸膠的中間，慢慢往兩邊放下膜，這樣一般氣泡很少。然后上層濾紙同樣用 U 型的放置方法，用玻璃棒稍微貼實(shí)下，最后蓋上海綿。

#5 出現(xiàn)黑點(diǎn)和黑斑

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牛奶溶解后，最好靜止一下，然后輕輕吸取上層牛奶進(jìn)行封閉，封閉結(jié)束后一定要洗?3 遍之后再加一抗。

#6 條帶拖尾

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這種情況一般出現(xiàn)在大分子量抗體實(shí)驗(yàn)中，是因?yàn)橐豢節(jié)舛忍?，作用時(shí)間太長引起的。另外洗一抗和洗二抗千萬不要偷工減漏，建議?5min*5 次，不要擔(dān)心洗這么多次把抗體和蛋白洗掉了，真正的抗原抗體相結(jié)合通過這種方式是洗不掉的。

#7 出現(xiàn)非均一性背景

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封閉時(shí)洗一抗洗二抗，以及發(fā)光時(shí)都應(yīng)時(shí)刻注意切記蛋白面風(fēng)干，一旦風(fēng)干很可能會(huì)導(dǎo)致這個(gè)結(jié)果。

#8 某個(gè)條帶變形

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很多實(shí)驗(yàn)室中使用的不是最新設(shè)備，比如配膠用的海綿墊，如果用了很多年，會(huì)從下面往上面漏小氣泡，當(dāng)氣泡足夠小并且膠快凝固的時(shí)候，走到中間的小氣泡就停留在膠內(nèi)，并會(huì)影響到后面的跑膠。另外配膠用的水，SDS，Tris 緩沖液要注意不要有雜質(zhì)。

#9 條帶不均一

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出現(xiàn)啞鈴最大的可能是膠沒有配好，膠凝固后不均一。如果你拔完梳子后出現(xiàn)上圖中下面部分的情況，多半會(huì)出現(xiàn)啞鈴狀。另外還有一種可能是樣品中含有太多雜質(zhì)，沒有離心下來，然后雜質(zhì)沉積在孔的中間，蛋白自然被推擠到兩邊。

#10 最邊緣條帶彎曲

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一般我們使用的是?10 孔的膠，如果你上樣剛好 10 個(gè)孔，那么最兩頭的兩個(gè)孔肯定會(huì)歪曲。另外上樣最好在膠的中間，這樣電場均一。

#11 條帶笑臉，marker正常

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準(zhǔn)備樣本主要確認(rèn)上樣緩沖液是否為近期配置，并且要妥善保存，否則就會(huì)浪費(fèi)珍貴的實(shí)驗(yàn)樣本。一般電泳過程中恒壓電泳，濃縮膠?80V，分離膠 120V，整個(gè)過程差不多需 2 個(gè)小時(shí)左右。

#12 曝光結(jié)果條帶扭曲

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對(duì)于大分子量的抗體，跑膠前可以先把樣本煮一下，然后稍微離心一下，同樣也可以改善這種情況。

二、7個(gè)WB靈魂提問

#1 為啥條帶形狀不好看？

可能的原因有：

a.膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻

b.某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或?qū)悠符}濃度調(diào)成一致

c.緩沖液陳舊，成分改變,可以重配

d.凝膠下面有氣泡,電泳前要先將氣泡趕走

e.電泳時(shí)溫度過高，可以降低電流或電壓

f.樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分?jǐn)嚢杌靹?/span>

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#2?蛋白條帶位置（大?。┎粚?duì)咋整？

可能的原因有：

a.膠濃度不對(duì)，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調(diào)整濃度

b.抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間

c.酶失活，建議直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物

d.目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關(guān)文獻(xiàn)確定

e.標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設(shè)置陽性對(duì)照比對(duì)結(jié)果，增加標(biāo)本上樣量

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#3?暗背景上白色帶是咋回事？

可能的原因有：

a.抗體與封閉試劑反應(yīng)，建議使用前過濾封閉試劑

b.HRP含量過高，建議降低酶聯(lián)二抗的濃度

c.HRP偶聯(lián)二抗中有聚集體，建議過濾二抗試劑，去除聚集體

d.抗體分布不均勻，建議孵育抗體時(shí)使用搖床

#4?細(xì)胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？

可能的原因有：

a.細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；

b.抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說明，是否有問題；

c.可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當(dāng)，樣品放置時(shí)間過長；

d.細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性。

#5?目的帶很弱，如何加強(qiáng)？

a.可以加大抗原上樣量，這是最主要的；

b..也可以將一抗稀釋比例降低；

c.還可以延長曝光時(shí)間。

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#6 我做的蛋白質(zhì)分子量很小(10KD)，怎么做WB?

a.可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系；

b.也可以選擇PSQ 膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。

#7?有很多雜帶咋回事？

可能的原因有：

a.目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)，本身可以呈現(xiàn)多條帶，建議查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小

b.樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作

c.雜蛋白多，建議處理目的蛋白

d.抗體特異性不強(qiáng)，建議使用特異性強(qiáng)的抗體

e.抗體孵育時(shí)間過久，建議減少抗體孵育時(shí)間

f.二抗與抗原有交叉反應(yīng)，建議選擇合適的封閉物

g.二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度

h.底物顯色與曝光時(shí)間過長，建議縮短顯色及曝光的時(shí)間

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三、電泳和轉(zhuǎn)印環(huán)節(jié)的?11 條 Tips

Tip 1：洗凈上樣孔

在加樣之前，用移液槍吹洗每個(gè)上樣孔，洗凈殘留在上樣孔中的丙烯酰胺殘?jiān)瑥亩苊饣螚l帶的出現(xiàn)。

Tip 2：凝膠過熱是大忌

如果凝膠在電泳過程中溫度過高，則條帶可能會(huì)出現(xiàn)「微笑」形狀，即條帶兩側(cè)向上彎曲的現(xiàn)象。切記要正確使用緩沖液，并控制好電泳功率，避免凝膠過熱的出現(xiàn)。

Tip 3：確保樣品緩沖液離子強(qiáng)度正確

樣品中的鹽離子強(qiáng)度過高（或過低），都會(huì)導(dǎo)致條帶出現(xiàn)偏斜或扭曲。如果樣品提取過程中用到高鹽溶液，就有可能要在上樣前進(jìn)行稀釋或脫鹽處理。

Tip 4：不要過載上樣

加大上樣量有利于檢測稀有目標(biāo)蛋白。但過大的上樣量會(huì)導(dǎo)致電泳過程中出現(xiàn)垂直條紋。如果必須大量上樣時(shí)（> 30 ug 總蛋白），可將電泳電壓降低 25％，有助于減少條紋。

Tip 5：轉(zhuǎn)印三明治要去除氣泡

均勻的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印需要三明治的各組件之間完全接觸，尤其是凝膠和膜完全接觸。沒有去除的氣泡會(huì)導(dǎo)致膜上出現(xiàn)空白點(diǎn)，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果！建議使用凝膠滾輪將這些氣泡通通趕走?。ㄌ崾荆禾荻饶z最好上下滾動(dòng)，而不是左右滾動(dòng)。左右滾動(dòng)會(huì)導(dǎo)致梯度凝膠翹曲和起皺。）

Tip 6：轉(zhuǎn)印前的預(yù)平衡

濕轉(zhuǎn)和傳統(tǒng)半干轉(zhuǎn)時(shí)，將凝膠電泳緩沖液替換為轉(zhuǎn)印緩沖液可獲得更好的轉(zhuǎn)印效果。電泳緩沖液的帶入會(huì)增加電導(dǎo)率，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)印過程中產(chǎn)生過多的熱量?？稍谒卸虝簺_洗凝膠，然后在轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡凝膠?15 分鐘，平衡膜 5 分鐘。請(qǐng)注意，對(duì)于某些快速轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，不建議使用凝膠預(yù)平衡，請(qǐng)遵循制造商的操作指南。

Tip 7：NC 膜轉(zhuǎn)印時(shí)避免使用 SDS

轉(zhuǎn)印緩沖液中的?SDS 會(huì)降低蛋白質(zhì)與硝酸纖維素膜的結(jié)合效率，所以在使用 NC 膜時(shí)要避免緩沖液體系內(nèi)有 SDS。轉(zhuǎn)印前用水沖洗凝膠，以便減少 SDS 帶入轉(zhuǎn)印體系。

Tip 8：PVDF 膜可使用 SDS

SDS 可以促進(jìn)蛋白質(zhì)從凝膠中洗脫，如果某些蛋白質(zhì)難以從凝膠中洗脫，則可以將 SDS 添加到轉(zhuǎn)印緩沖液中，前提是必須使用 PVDF 膜。

Tip 9：避免膜變干

在轉(zhuǎn)印之前和之后均需保證膜的濕潤，從轉(zhuǎn)印三明治中取出后，轉(zhuǎn)印熱量會(huì)使膜容易變干燥。應(yīng)迅速將膜浸入預(yù)先準(zhǔn)備好的緩沖液中，以免膜干燥。（尤其是在使用?PVDF 膜時(shí)要格外注意，因?yàn)?PVDF 膜是疏水的更容易變干）。如果干了，可將硝酸纖維素膜重新在緩沖液中浸濕，而 PVDF 膜則需要在醇中重新活化。

Tip 10：半干轉(zhuǎn)印功率及時(shí)間設(shè)置

使用高電場轉(zhuǎn)印可獲得更高的轉(zhuǎn)印效率，但是一定要注意系統(tǒng)的散熱能力，避免凝膠過熱。轉(zhuǎn)印期間，「三明治」溫度升高會(huì)導(dǎo)致電阻變化，進(jìn)而引發(fā)轉(zhuǎn)印效率不均一，緩沖液失去緩沖能力，甚至凝膠融化。半干轉(zhuǎn)印在電流下降接近為零時(shí)，延長轉(zhuǎn)印時(shí)間不會(huì)增加轉(zhuǎn)印效果。

Tip 11：使用兩張膜判斷蛋白是否會(huì)轉(zhuǎn)穿

薄膠或低濃度膠轉(zhuǎn)印過程中蛋白容易轉(zhuǎn)穿，特別是針對(duì)小分子量蛋白。可以轉(zhuǎn)印時(shí)疊放兩張轉(zhuǎn)印膜，然后對(duì)第二張膜進(jìn)行總蛋白染色（麗春紅或?Stain-Free 免染）的方法來判斷是否已經(jīng)轉(zhuǎn)穿。

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