NOX4/NLRP3炎癥小體通路的激活與其他器官的纖維化有關(guān)。腸道細(xì)菌失衡是肝纖維化的重要驅(qū)動(dòng)因素。2021年9月，南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院朱萱課題組在Gut Microbes期刊（IF:10.245）上發(fā)表了題為“Ursolic acid reverses liver fibrosis by inhibiting NOX4/NLRP3 inflammasome pathways and bacterial dysbiosis”的研究論文，旨在探討熊果酸（UA）抗肝纖維化作用是否與NOX4/NLRP3炎癥小體通路和腸道細(xì)菌有關(guān)，為今后的治療奠定基礎(chǔ)。文章中的微生物多樣性測序服務(wù)由歐易生物提供。

?研究背景?

肝硬化的一個(gè)共同特征是潛在致病菌的增加和有益細(xì)菌的減少。腸道微生物失衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌易位，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，肝臟損傷甚至肝纖維化。NLRP3是一種廣泛參與細(xì)胞免疫的細(xì)胞內(nèi)多蛋白復(fù)合物，可對(duì)有害信號(hào)作出反應(yīng)，啟動(dòng)修復(fù)反應(yīng)。之前的研究表明NLRP3炎性小體激活與卵巢、腎臟和心臟纖維化相關(guān)。NADPH氧化酶4（NOX4）?通過細(xì)胞凋亡和肝星狀細(xì)胞（HSCs）激活促進(jìn)肝纖維化的關(guān)鍵因子。然而關(guān)于NOX4/NLRP3信號(hào)通路在肝纖維化中的作用研究甚少。

肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與腸道細(xì)菌紊亂密切相關(guān)。已有研究表明NLRP3炎性小體能夠識(shí)別腸道細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物，發(fā)揮腸道免疫功能，從而保護(hù)腸道。熊果酸（UA）通過抑制肝臟炎癥、選擇性誘導(dǎo)活化的造血干細(xì)胞凋亡和抑制造血干細(xì)胞增殖來減輕肝纖維化，但具體機(jī)制尚不清楚。由于NOX4和NLRP3炎性小體與許多器官纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這些因子也與腸道細(xì)菌的變化有關(guān)。因此，探索UA的抗纖維化機(jī)制是否與NOX4/NLRP3信號(hào)通路及腸道菌群調(diào)控有關(guān)，可以為今后的治療奠定基礎(chǔ)，對(duì)延緩肝纖維化的發(fā)展至關(guān)重要。

?研究結(jié)果?

1.?熊果酸（UA）逆轉(zhuǎn)肝損傷、肝纖維化和細(xì)菌易位

HE染色，Masson染色和Sirius red染色結(jié)果表明，UA處理顯著降低了CCl4對(duì)小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)、纖維間隔形成及膠原沉積的影響，炎癥細(xì)胞浸潤減少（圖1a，1c，1d）。ELISA結(jié)果顯示，CCl4組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和羥脯氨酸水平較對(duì)照組來說顯著提高（P< 0.050）。然而，UA處理降低了這種效果（圖1b）。?

圖1?UA可改善CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的肝損傷和肝纖維化

免疫組化結(jié)果顯示，在CCl4組的肝組織中α-SMA、Collagen-1等激活的肝星狀細(xì)胞（HSCs）標(biāo)志物顯著高于對(duì)照組（P<0.050）。TUNEL染色結(jié)果表明，CCl4組肝細(xì)胞凋亡增加。然而，在UA組中這兩種效應(yīng)明顯逆轉(zhuǎn)（圖2a）。這一結(jié)果表明，UA可以抑制HSCs的激活和肝細(xì)胞凋亡。在mRNA和蛋白水平上，CCl4組中肝纖維化相關(guān)因子（α-SMA、Collagen-1和TIMP-1）的表達(dá)在CCl4組（P<0.001）中增加，而抗纖維化因子MMP-1的表達(dá)減少（P<0.010）。UA治療后，抗纖維化因子MMP-1的表達(dá)增加（P<0.010）（圖2b-d）。這一結(jié)果表明，UA可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

圖2?UA通過影響纖維化相關(guān)因子的表達(dá)來發(fā)揮抗纖維化作用

2.?熊果酸通過抑制NOX4和NLRP3炎癥信號(hào)減輕肝纖維化

免疫組化結(jié)果顯示，CCI4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠NOX4和NLRP3表達(dá)上調(diào)，UA治療后NOX4和NLRP3表達(dá)明顯（P<0.050）降低（圖3a）。PCR和Western blotting（P<0.050）顯示相似的結(jié)果（圖3c-e）。這一發(fā)現(xiàn)表明肝纖維化的發(fā)展與這兩個(gè)因子的表達(dá)有關(guān)。

圖3?熊果酸通過抑制NOX4和NLRP3信號(hào)通路減輕CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化

3.?抑制NLRP3表達(dá)可有效緩解肝纖維化

HE染色，Masson染色和Sirius red 染色結(jié)果表明，與注射CCl4的WT小鼠相比，NLRP3?/-組小鼠的膠原沉積明顯減輕（P<0.001）（圖4a-c）。此外，抑制NLRP3后，CCl4誘導(dǎo)的小鼠ALT（P<0.050）、AST（P<0.010）和羥脯氨酸（P<0.050）水平顯著降低（圖4d）。肝纖維化相關(guān)指標(biāo)表達(dá)變化相似（圖4e-g），表明NLRP3是肝纖維化過程中重要的促纖維化因子。與NLRP3?/-組相比，NLRP3?/-+UA組膠原沉積和纖維間隔形成變化不明顯。血清指標(biāo)和肝纖維化相關(guān)因素的變化也不明顯（圖4a-g）。在NLRP3?/-+UA小鼠中，與CCl4組相比，NOX4的mRNA和蛋白表達(dá)均降低（P<0.050）（圖4h-j）。

圖4?UA對(duì)NLRP3?- /-小鼠NLRP3炎癥小體表達(dá)的影響

4.?抑制NOX4表達(dá)可有效緩解肝纖維化

與肝纖維化WT小鼠相比，NOX4?/-+CCl4和CCl4+AP組小鼠的膠原沉積較少（P<0.050）（圖5a-c）。同樣，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和羥脯氨酸水平也低于WT小鼠（圖5d），表明抑制NOX4可顯著恢復(fù)肝功能。相關(guān)纖維化因子的表達(dá)也表明NOX4在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用（圖5e-g）。這些結(jié)果表明，抑制NOX4可以改善肝纖維化，并且NOX4是一種重要的促肝纖維化因子。HE染色, Masson染色和Sirius red染色結(jié)果顯示，與NOX4?/-+CCl4組和CCl4+AP組比較，NOX4組膠原沉積和纖維間隔形成無明顯差異，但仍低于WT組（P<0.010）（圖5a-c）。同樣，UA治療后血清肝功能損害指標(biāo)也有一定程度的恢復(fù)，促纖維化因子表達(dá)下調(diào)，抗纖維化因子表達(dá)上調(diào)（圖5d-g）。

圖5 UA對(duì)NOX4?/-小鼠NLRP3表達(dá)的影響

5.?NOX4有效刺激了NLRP3表達(dá)

NLRP3?/-+CCl4小鼠與WT+CCl4小鼠相比，NOX4的mRNA和蛋白表達(dá)均無明顯降低（P>0.050）（圖4h-j）。所有NOX4?/-小鼠的NLRP3的mRNA和蛋白水平均顯著低于WT+CCl4組（P<0.010）（圖5h-j）。這表明，NOX4可能是NLRP3的上游信號(hào)。

6.?微生物豐度多樣性的比較

檢測了四組的α多樣性指標(biāo)（Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)），以了解腸道微生物多樣性（圖6a，b）（P<0.050）。CCl4組的多樣性顯著低于對(duì)照組，而NOX4?/-組和NLRP3?/-組的多樣性顯著高于CCl4組。分析β多樣性進(jìn)一步評(píng)估各組之間腸道結(jié)構(gòu)的差異（圖6c，d）。PCoA圖和NMDS分析顯示，對(duì)照組、CCl4組、NOX4?/-組和NLRP3?/-組的腸道結(jié)構(gòu)存在差異，微生物種類的豐度也不同（圖6e）。

圖6 四組CCl4致肝纖維化小鼠腸道微生物多樣性的變化

7.?微生物豐度組成的比較

在微生物豐度方面，門水平（圖7a-c）上，在CCl4組有益細(xì)菌Firmicuts的豐度低于對(duì)照組（P<0.001）。NOX4?/-組和NLRP3?/-組Firmicuts豐度顯著增加（P<0.001）。而有害細(xì)菌變形桿菌則表現(xiàn)出相反的趨勢（P<0.050）。在種水平上（圖7d-i），與對(duì)照組相比，CCl4組小鼠腸道微生物群中攜帶了更多的Akkermansia菌（P<0.001）和更少的有益乳桿菌（P<0.010）。與CCl4組相比，NOX4?/-組和NLRP3?/-組的變化趨勢完全相反。

圖7 四組CCl4致肝纖維化小鼠的微生物豐度

8.?腸道結(jié)構(gòu)與環(huán)境因素的關(guān)系

有益菌乳酸菌和有害菌Akkermansia與肝功能指標(biāo)（AST、ALT、羥脯氨酸）相關(guān)，有害菌Akkermansia與這三項(xiàng)指標(biāo)呈正相關(guān)。這一結(jié)果表明，腸道中有害菌的豐度隨著肝功能損害的增加而增加。抑制NOX4/NLRP3炎癥體信號(hào)通路可以減少有害菌的數(shù)量，增加有益菌的數(shù)量。UA通過NOX4/NLRP3炎癥小體途徑改善腸道結(jié)構(gòu)。

圖8 肝纖維化小鼠中微生物豐度與AST、ALT和羥脯氨酸之間的潛在聯(lián)系

?研究結(jié)論?

本研究表明，NOX4/NLRP3炎性小體信號(hào)通路在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，是腸道細(xì)菌調(diào)控的重要靶點(diǎn)。UA通過該信號(hào)通路發(fā)揮抗纖維化作用，NOX4/NLRP3炎性小體是治療慢性肝病的關(guān)鍵抗纖維化靶點(diǎn)。

原文鏈接：https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2021.1972746

END

Vivilla?? 撰文

本文系歐易生物原創(chuàng)

轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明文本轉(zhuǎn)自歐易生物