據(jù)估計，全世界的醫(yī)院和組織庫中大概有四億到十億份FFPE樣本。對于某些類型的腫瘤組織，F(xiàn)FPE樣品通常是核酸的來源，這些樣本可以為研究人員提供有關(guān)某些罕見的癌癥和其他疾病的重要信息。利用FFPE樣本進行DNA高通量測序已經(jīng)是常規(guī)技術(shù)（全外顯子測序和重測序），且已經(jīng)產(chǎn)生了大量數(shù)據(jù)。而使用FFPE樣本開展轉(zhuǎn)錄組水平的測序工作報道相對比較少。

今年3月，Frontiers in Endocrinology(IF:6.055)發(fā)表的一篇文章評估了腎上腺皮質(zhì)腫瘤FFPE樣本可以進行全轉(zhuǎn)錄組測序的效果。從本文結(jié)果來看，F(xiàn)FPE樣本是可以用來進行RNA抽提和建庫測序，且其數(shù)據(jù)結(jié)果與新鮮凍存樣本的數(shù)據(jù)結(jié)果差異不大。

一、樣本：

1、腎上腺皮質(zhì)癌樣本（ACC）新鮮凍存和FFPE樣本各3份；

2、產(chǎn)生醛固酮的腺瘤（APA）新鮮凍存和FFPE樣本各3份；

3、皮質(zhì)醇生成腺瘤（CPA）新鮮凍存和FFPE樣本各3份。

二、材料與方法

1、RNA抽提質(zhì)檢：

（1）新鮮凍存樣本使用Trizol抽提RNA，F(xiàn)FPE樣本使用Promega的Maxwell RSC RNA FFPE kit抽提RNA。

（2）RNA質(zhì)檢使用Bioanalyzer 2100， RNA質(zhì)量的判定使用RIN值和DV200兩項指標(biāo)。

2、建庫：

使用NEBNext rRNA去除試劑盒及NEBNext Ultra II Direcational RNA建庫試劑盒。

三、結(jié)果分析

1、RNA抽提分析

與新鮮凍存的樣本相比，F(xiàn)FPE樣本的RNA抽提得率、RIN值和DV值均偏低（圖1）。FFPE樣本的RNA濃度平均值為36ng/μL， RIN值平均值僅為2.2， DV200平均值為47.6%；而新鮮凍存樣本的RNA濃度為464.5ng/μL， RIN值平均值為7.9，DV200平均值為71%。將FFPE樣本分成存放時間大于340天小于340天兩組，新鮮凍存樣本分成存放時間大于427天和小于427天，分別對RNA濃度、RIN值和DV200進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，無論是FFPE樣本還是冷凍樣本存放時長對RNA的得率、RIN值和DV200均無明顯影響。

圖1 | FFPE與新鮮凍存樣本RNA質(zhì)控統(tǒng)計

2、RNA測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果

（1）FFPE樣本與新鮮凍存樣本RNA分別建庫測序，得到的原始數(shù)據(jù)相近，分別為33M reads和32.9M reads。但是兩者的基因組比對率差異較大，其中FFPE樣本的基因組比對率為82.9%，而凍存樣本的基因組為 87.7%。因此FFPE樣本所得到的可用于分析的reads數(shù)明顯少于凍存樣本。但是二者分析得到的基因數(shù)并無明顯差別，平均值分別為18160 和 18001。

圖2 | FFPE樣本和新鮮凍存樣本可分析reads數(shù)和鑒定到的基因數(shù)

（2）用標(biāo)準(zhǔn)化后的測序數(shù)據(jù)進行各組樣本的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FPE樣本與新鮮凍存樣本數(shù)據(jù)的相關(guān)性的平均值為0.93（圖3），而且采用FFPE樣本所得到的基因表達結(jié)果與新鮮凍存樣本的表達結(jié)果相似，但是可檢測的轉(zhuǎn)錄本數(shù)少于新鮮凍存細(xì)胞。

圖3 | FFPE樣本與新鮮凍存樣本測序數(shù)據(jù)的相關(guān)性

（3）為確認(rèn)FFPE樣本的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果是否能夠用于區(qū)分ACC、APA和CPA樣本，首先評估了新鮮凍存樣本的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)是否能夠區(qū)分上述三種癌癥，結(jié)果表明新鮮凍存樣本可以較好的對三種癌癥進行區(qū)分，而對FFPE樣本的測序數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FPE樣本所得到的結(jié)果與新鮮凍存樣本結(jié)果一致（圖4）。

圖4| 聚類分析結(jié)果

（4）對比同組的FFPE樣本和新鮮凍存樣本的基因表達情況，ACC組的FFPE樣本中有402個差異基因，其中161個上調(diào)，241個下調(diào)。在ACC組的新鮮凍存樣本中則有356個差異表達基因，其中148個上調(diào)，208個下調(diào)，兩者的共有基因為193個，其中76個上調(diào)，117個下調(diào)。

對APA和CPA的FFPE樣本和新鮮凍存樣本分別進行分析，結(jié)果表明FFPE樣本產(chǎn)生的數(shù)據(jù)能夠用來鑒定APA和CPA特異基因。

四、結(jié)論

1、FFPE樣本能夠用來抽提RNA并進行轉(zhuǎn)錄組建庫測序；

2、FFPE樣本抽提RNA得率、RIN值及DV200與新鮮凍存樣本有較大差異；

3、在腎上腺皮質(zhì)腫瘤中可以使用FFPE樣本替代新鮮凍存樣本進行疾病marker基因的鑒定；

4、在腎上腺皮質(zhì)腫瘤的FFPE樣本的RNA表達模式與新鮮凍存樣本的RNA表達模式高度相似；

5、FFEP樣本能夠進行組織形態(tài)觀察，從而使顯微切割獲得特定部位的組織和細(xì)胞成為可能；

6、本篇文章的缺點是沒有能夠取到保存年限更長的樣本進行研究。

7、本篇文章為大量的FFPE樣本的使用挖掘提供了新思路。

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