中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所賀玖明研究員團(tuán)隊(duì)以封底文章在《藥學(xué)學(xué)報(bào)》英文刊（APSB）2022年第8期（IF：14.903）發(fā)表了題為“A temporo-spatial pharmacometabolomics method to characterize pharmacokinetics and pharmacodynamics in the brain microregions by using ambient mass spectrometry imaging”的研究論文，建立了一種時(shí)空分辨的代謝組學(xué)方法（基于AFADESI-MSI的時(shí)空藥物代謝組學(xué)），可全景式描繪腦中藥物代謝和效應(yīng)的時(shí)空特征，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用新藥研發(fā)提供了一種有力的可視化工具和新的視角。

封底圖 | 表征鼠腦中中樞神經(jīng)藥物的微區(qū)域藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)的時(shí)空代謝組學(xué)方法策略和工作流程

研究背景

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）具有復(fù)雜而脆弱的結(jié)構(gòu)，在大腦的許多微區(qū)域之間具有高度的互連性和相互作用。大腦是人體復(fù)雜的器官，可以細(xì)分為許多微區(qū)域。腦中多種內(nèi)源性功能代謝物在不同的微區(qū)分布不均勻。腦微區(qū)的代謝酶、受體、配體、蛋白和血流的功能差異也會(huì)導(dǎo)致藥物的空間分布和療效差異。大腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的靶點(diǎn)，大多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥品只有在進(jìn)入大腦后才會(huì)發(fā)揮作用。因此了解藥物及相關(guān)內(nèi)源代謝物在大腦中的原位分布的信息對(duì)于評(píng)估藥物療效、毒理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)具有重要意義。

目前研究大腦的常用功能性腦成像技術(shù)（包括組織化學(xué)標(biāo)記、免疫熒光、MRI、PET、全身放射自顯影等），僅提供腦組織結(jié)構(gòu)的圖像，不能在分子水平上進(jìn)行分析，可監(jiān)測(cè)的物質(zhì)種類也有限。另一方面，腦內(nèi)藥物分析通常使用的基于組織勻漿或微透析采樣的高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）技術(shù)獲得的結(jié)果僅能反映采樣微區(qū)的平均代謝水平，而缺乏分子在整個(gè)大腦中的空間分布的信息。質(zhì)譜成像技術(shù)（MSI）不需要復(fù)雜的預(yù)處理和特殊的化學(xué)標(biāo)記，具有高通量、高靈敏度和高分辨率的特點(diǎn)，可檢測(cè)已知或未知小分子代謝物的定性、定量和空間分布信息。

本研究使用AFADESI-MSI空間代謝組學(xué)研究表征了臨床中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物奧氮平（OLZ）和大鼠腦內(nèi)內(nèi)源性代謝物，并進(jìn)行了給藥期間的時(shí)空變化以及腦微區(qū)藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)研究，成功地展示了OLZ及其作用相關(guān)代謝物的時(shí)空特征，并為中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物作用的分子機(jī)制提供了新的見解。

研究思路

研究方法

1. 實(shí)驗(yàn)分組/研究材料：飼養(yǎng)一周的雄性 Sprague-Dawley 大鼠

（1） 實(shí)驗(yàn)組：4組（3只/組），口服OLZ溶液（50mg/mL）后 20 分鐘、50 分鐘、3 小時(shí)和 12 小時(shí)用高濃度乙醚。

（2） 對(duì)照組：1組，3只/組

2.技術(shù)路線

2.1. 鼠腦的微區(qū)劃分：15個(gè)微區(qū)，包括尾狀殼核（CP）、大腦皮質(zhì)（CTX）、海馬（HP）、下丘腦（HY）、丘腦（TH）、小腦皮質(zhì)（CBC）、小腦髓質(zhì)(CM)、髓質(zhì) (MD)、腦橋 (PN)、大腦導(dǎo)水管 (CA)、中腦 (MB)、穹窿 (FN)、梨狀皮質(zhì) (PC)、嗅球 (OB) 和胼胝體 (CC)。

2.2 質(zhì)譜成像：AFADESI-MSI分析（全掃描及MS2掃描）

2.3代謝物定性：人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù) (www.hmdb.ca)、Metlin、MassBank和LIPID MAPS

研究結(jié)果

1.通過AFADESI-MSI繪制大鼠大腦中的內(nèi)源性代謝物和藥物圖譜

無論是正離子模式還是負(fù)離子模式，使用AFADESI-MSI空間代謝組學(xué)均可從治療組和對(duì)照組腦組織切片中獲得內(nèi)源性代謝物信息。在100-500 Da的低質(zhì)量范圍內(nèi)，可以檢測(cè)到氨基酸、核苷、核苷酸、有機(jī)酸、脂肪酸等極性小分子代謝物和γ-氨基丁酸 (GABA)、肌酸、肉堿、乙酰肉堿和磷脂酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)類代謝物；在500-1000 Da的高質(zhì)量范圍內(nèi)，可以檢測(cè)到一些脂質(zhì)，包括鞘磷脂（SM）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰膽堿（PC）、溶血磷脂酰膽堿（LysoPC）和磷脂酰肌醇 (PI) 等。原型藥物 OLZ 及其代謝物 2-羥甲基 OLZ 在正離子模式下被檢測(cè)，結(jié)果如圖1C1和D1所示。這些結(jié)果表明，非靶向質(zhì)譜成像的方法可以在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)繪制外源性藥物和內(nèi)源性代謝物的圖譜，并可以獲得它們的空間分布特征和微區(qū)域豐度變化。

圖1 | 使用 AFADESI-MSI 從腦組織切片獲得的外源性藥物和內(nèi)源性代謝物的質(zhì)譜成像結(jié)果

2.鼠腦中奧氮平（OLZ）及其代謝物的時(shí)空變化

OLZ是一種用治療精神分裂癥的藥物，大腦是其主要靶器官。本實(shí)驗(yàn)為探究給藥時(shí)間藥物在大腦各功能微區(qū)的分布情況，分別在給藥后20 min、50 min、3 h和12 h收集治療組和對(duì)照組大鼠腦組織進(jìn)行MSI分析。OLZ 及其代謝物 2-羥甲基 OLZ 的在鼠腦分布結(jié)果如圖2A所示。

這些結(jié)果表明，OLZ 可以很容易地穿透腦血屏障，主要分散在腦室和腦實(shí)質(zhì)組織中，但并不是均勻分布在大腦的所有微區(qū)域中。給藥后20分鐘發(fā)現(xiàn)OLZ主要分布在大腦皮質(zhì)中。50分鐘后，OLZ的水平顯著增加。隨著時(shí)間的推移，大腦中的藥物信號(hào)迅速下降到成像檢測(cè)限以下。同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)，2-羥甲基OLZ主要分布在穹窿中，其在各個(gè)微區(qū)的分布格局與OLZ不同。

這些結(jié)果表明，OLZ藥物的吸收、分布和代謝的速率在大腦的不同微區(qū)不同，表明微區(qū)對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)有影響。它還證明了所提出的基于 AFADESI-MSI 的時(shí)空藥物代謝組學(xué)方法能夠同時(shí)說明藥物及其代謝物在大腦復(fù)雜微區(qū)域中的水平和空間分布的變化。

圖2 |?腦微區(qū)OLZ和其代謝產(chǎn)物2-羥甲基OLZ的時(shí)空變化

3.OLZ 對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)類代謝物的的微區(qū)調(diào)控

OLZ藥物治療精神分裂的作用機(jī)制是阻斷多巴胺 D2 受體或血清素 2A 受體調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)類代謝物（NTs）。然而OLZ的微區(qū)效應(yīng)和分子作用機(jī)制仍不清楚。因此作者分析了與OLZ生理活動(dòng)密切相關(guān)的NTs的時(shí)空變化，包括GABA、Glu、谷氨酰胺 (Gln) 和腺苷。NTs的AUC變化率如圖3B1-B7所示。

GABA（γ-氨基丁酸）是中樞神經(jīng)中的一種神經(jīng)遞質(zhì)，可抑制神經(jīng)中樞。空間代謝組檢測(cè)結(jié)果顯示GABA（m/z 104.0706）主要分布在下丘腦中，藥物干預(yù)后下丘腦的 GABA 受到輕微調(diào)節(jié)。但同時(shí)在梨狀皮質(zhì)和嗅球中觀察到藥物干預(yù)后GABA顯著上調(diào)。Glu 是中樞神經(jīng)中的一種主要神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有興奮作用。在藥物干預(yù)后，Glu及其代謝物Gln的時(shí)空動(dòng)態(tài)模式在腦部微區(qū)中呈現(xiàn)出相對(duì)一致的變化趨勢(shì)。腺苷廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，是大腦中的一種興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，并在腦中不均勻分布。并且在給藥3小時(shí)后海馬和下丘腦中的高水平腺苷顯著增加，表明當(dāng)藥物積累時(shí)腺苷的上調(diào)會(huì)更加明顯。組胺、乙酰膽堿（Ach）、?；撬岬壬窠?jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)都有各自特征的微區(qū)分布，以及在給藥后具有上調(diào)的趨勢(shì)。

上述神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)的靶向成像分析結(jié)果表明，該方法可以檢測(cè)到與中樞神經(jīng)藥物作用機(jī)制相關(guān)的大量原型藥物及其代謝物和內(nèi)源性代謝物的空間分布和變化。這對(duì)于闡明中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的作用機(jī)制和了解精神分裂癥及相關(guān)疾病具有重要意義。

圖3 |?藥物對(duì)腦內(nèi)NTs分布和AUC變化率的影響

4. OLZ 藥物干預(yù)的微區(qū)代謝調(diào)控

組織和器官的內(nèi)源性代謝變化可以反映藥物刺激的效果。為探索藥物干預(yù)后的微區(qū)代謝效應(yīng)，通過藥物代謝組學(xué)測(cè)試研究了內(nèi)源性代謝物的分子譜及其動(dòng)態(tài)變化的分布信息。分別在OLZ和生理鹽水給藥后 50分鐘采集每組治療和對(duì)照大鼠的三個(gè)腦組織樣本進(jìn)行微區(qū)域分析。

OPLS-DA結(jié)果表明，基于正離子模式和負(fù)離子模式下腦微區(qū)的定量分析，對(duì)照組和治療組分別明顯分開?？偣埠Y選和鑒定了 90 種差異內(nèi)源性代謝物，作為藥物作用相關(guān)效應(yīng)物,它們?cè)诖竽X微區(qū)域中發(fā)揮了巨大作用。其中81種被MS2鑒定，9 種被同位素模式鑒定。差異代謝物包含了很多種類型的代謝物，包括氨基酸、脂肪酸、甘油磷脂、有機(jī)酸、多胺和?；鈮A。

經(jīng)過分析確定了治療組和對(duì)照組之間顯著差異的七種代謝途徑，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、?；撬岷蛠喤；撬岽x、淀粉和蔗糖代謝、甘油磷脂代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、精氨酸生物合成、嘌呤代謝和檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）。下面對(duì)影響較大的丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和甘油磷脂代謝的異常代謝途徑進(jìn)行重點(diǎn)分析。

圖4 |?對(duì)照組和治療組中鑒定的差異代謝物的層次聚類分析 (HCA)

4.1 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝紊亂

異常的Glu-Gln循環(huán)在精神分裂癥的病理生理過程中起重要作用。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑代謝物在老鼠腦的時(shí)空分布如圖5所示。檸檬酸在大腦大部分微區(qū)分布均勻；與對(duì)照組相比，表達(dá)顯著提高，結(jié)果提示藥物干預(yù)加速了TCA循環(huán)的代謝，為機(jī)體提供了更多能量。Glu也均勻分布在各個(gè)微區(qū)，藥物干預(yù)后呈下調(diào)趨勢(shì)。它的代謝物Gln 和 GABA，主要在下丘腦和的多個(gè)微區(qū)中上調(diào)。

根據(jù)通路分析和代謝谷氨酸脫羧酶（GAD）酶反應(yīng)，推測(cè)OLZ直接激活GAD促進(jìn)GABA合成。GABA可增加糖酵解中己糖激酶的活性，從而加速葡萄糖的代謝?？臻g分布結(jié)果表明葡萄糖分布在大腦的所有微區(qū)，但給藥后主要分布在梨狀皮質(zhì)和嗅球中，給藥后20分鐘血糖水平顯著升高。

圖5 |?丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑代謝物的時(shí)空分布

4.2.甘油磷脂代謝途徑的紊亂

甘油磷脂有助于控制肝臟脂質(zhì)代謝，促進(jìn)記憶力，增強(qiáng)免疫力，延緩衰老。甘油磷脂代謝途徑代謝物的時(shí)空分布如圖6。這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，在給藥后，大多數(shù)脂質(zhì)在大多數(shù)微區(qū)域中顯示出上調(diào)。OLZ在臨床應(yīng)用中具有代謝副作用，如體重增加、血脂異常、高甘油三酯血癥和胰島素抵抗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，脂質(zhì)代謝的上調(diào)可能導(dǎo)致OLZ治療期間的副作用。

圖6 | 甘油磷脂代謝途徑代謝物的時(shí)空分布

相關(guān)討論

作者開發(fā)的時(shí)空藥物代謝組學(xué)方法，使用質(zhì)譜成像技術(shù)MSI來表征大腦中樞神經(jīng)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)。結(jié)果表明，該方法可有效識(shí)別與藥物作用相關(guān)的內(nèi)源性分子效應(yīng)物。評(píng)估OLZ藥物對(duì)腦組織的微區(qū)域效應(yīng)，并證明其穿過血腦屏障后的微區(qū)域藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)方面的有效性。該方法清楚地展示了原型藥物及其代謝物 2-羥甲基OLZ在大鼠大腦不同微區(qū)的藥代動(dòng)力學(xué)。也在腦部微區(qū)現(xiàn)一些神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)和其它小分子極性代謝物，并顯示出與藥物干預(yù)相關(guān)的多種代謝途徑。發(fā)現(xiàn)天冬氨酸、谷氨酸和甘油磷脂代謝途徑的調(diào)節(jié)可能與 OLZ 臨床使用觀察到的治療和不良反應(yīng)有關(guān)，為了解其作用的分子機(jī)制提供了關(guān)鍵信息。

小鹿

與基于LC-MS的常規(guī)藥物代謝組學(xué)分析手段相比，基于AFADESI-MSI的時(shí)空藥物代謝組學(xué)技術(shù)具有同時(shí)檢測(cè)內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的靜態(tài)水平變化，并提供大腦不同微區(qū)的動(dòng)態(tài)時(shí)間依賴性趨勢(shì)和空間分布信息的優(yōu)勢(shì)，能夠非常準(zhǔn)確地呈現(xiàn)原位和微區(qū)域分子變化規(guī)律。在此基礎(chǔ)上將藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)與代謝途徑相關(guān)聯(lián)，有利于獲得關(guān)鍵信息，從而更深入地了解藥物作用的分子機(jī)制。基于 AFADESI-MSI 的時(shí)空藥物代謝組學(xué)技術(shù)不僅是闡述中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的原位藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)全面有效的工具，也可為腦組織內(nèi)源性代謝物的變化以及其它動(dòng)物組織的原位代謝研究提供重要信息。

該研究工作，藥物所2017級(jí)碩士研究生劉丹為作者，賀玖明研究員為獨(dú)立通訊作者。工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金和醫(yī)科院創(chuàng)新工程項(xiàng)目的資金資助。

賀玖明博士，博士生導(dǎo)師，藥物分析專業(yè)；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所研究員，主要研究方向：質(zhì)譜成像空間分辨代謝組學(xué)新技術(shù)新方法及其生物醫(yī)藥應(yīng)用研究。開發(fā)出空氣動(dòng)力輔助離子化及質(zhì)譜成像新技術(shù)和空間分辨代謝組學(xué)新方法，建立了以空間分辨代謝組學(xué)技術(shù)為特色的新藥代謝研究平臺(tái)。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局創(chuàng)新藥物安全與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室學(xué)委委員；擔(dān)任《藥學(xué)學(xué)報(bào)》、Acta Pharm Sin B、J Pharm Anal青年編委，Molecules、TMR Modern Herbal Medicine和《藥學(xué)研究》編委；中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)藥物分析技術(shù)分會(huì)常務(wù)委員，中國(guó)質(zhì)譜學(xué)會(huì)常務(wù)委員。

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