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????????今天推薦的是由武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究所在2019年9月11日發(fā)表于Nature Communications（2020IF：14.920，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Hong-Bing Shu教授，研究表明K27連接的多泛素化和去泛素化對TRIF介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。

研究背景

????????含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭誘導(dǎo)干擾素-β(TRIF)是由Toll樣受體(TLR)3-和TLR4介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)所需的重要接頭蛋白。

摘要部分

????????在這里，作者將USP19確定為TLR3/4介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的負調(diào)節(jié)器。USP19缺乏會在體外和體內(nèi)增加由聚(I:C)或LPS誘導(dǎo)的I型干擾素(IFN)和促炎細胞因子的產(chǎn)生。Usp19-/-小鼠在poly(I:C)或LPS治療后有更嚴(yán)重的炎癥，并且在感染鼠傷寒沙門氏菌后更容易受到炎癥損傷和死亡。從機制上講，USP19與TRIF相互作用并催化TRIF K27連接的多泛素部分的去除，從而抑制TRIF向TLR3/4的募集。此外，RINGE3泛素連接酶復(fù)合物Cullin-3-Rbx1-KCTD10在K523處催化K27連接的TRIF多泛素化，并且該復(fù)合物的缺乏會抑制TLR3/4介導(dǎo)的先天免疫信號傳導(dǎo)。因此，作者的研究結(jié)果揭示了TRIF K27連接的多泛素化和去泛素化是TLR3/4介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機制。

研究內(nèi)容

1.USP19負向調(diào)節(jié)TLR3/4介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)? ? ? ?

????????為了鑒定調(diào)節(jié)TLR3介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的去泛素化酶(DUB)，作者通過IFN-β啟動子報告基因檢測篩選了25個DUB，并將USP19鑒定為候選物。USP19的過表達在293-TLR3細胞中以劑量依賴性方式抑制了聚（I:C）誘導(dǎo)的IFN-β啟動子、ISRE和NF-κB的激活。qPCR分析表明USP19的過表達抑制了poly(I:C)誘導(dǎo)的下游抗病毒基因轉(zhuǎn)錄，包括IFNB1、ISG56、TNF和CXCL10以及TBK1、p65和IRF3的磷酸化。這些結(jié)果表明USP19的過表達抑制了poly(I:C)和LPS觸發(fā)的IRF3和NF-κB激活。

????????作者接下來探究了內(nèi)源性USP19在調(diào)節(jié)TLR3/4介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)中的作用。作者構(gòu)建了USP19缺陷型293-TLR3、293-TLR4細胞。qPCR實驗表明293-TLR3細胞中的USP19缺陷增強了poly(I:C)-誘導(dǎo)IFNB1、ISG56、TNF和CXCL10基因的轉(zhuǎn)錄。這些數(shù)據(jù)表明內(nèi)源性USP19在人和小鼠細胞系中特異性抑制TLR3/4介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。

????????為了研究USP19在體內(nèi)的功能，作者通過CRISPR/Cas9技術(shù)生成了USP19缺陷小鼠。作者首先從野生型和USP19缺陷小鼠中制備了骨髓來源的巨噬細胞(BMDM)、樹突細胞(DC)和小鼠肺成纖維細胞(MLF)。與上述實驗一致，作者發(fā)現(xiàn)USP19缺陷增強了poly(I:C)-和LPS誘導(dǎo)BMDM和DC中下游效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，與野生型相比，聚(I:C)-和LPS誘導(dǎo)的TBK1、IRF3、p65和IκBα磷酸化在Usp19-/-BMDM細胞中顯著增加。

研究結(jié)論：USP19在原代小鼠免疫細胞或成纖維細胞中負向調(diào)節(jié)TLR3/4介導(dǎo)的下游效應(yīng)基因的誘導(dǎo)。

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2.USP19缺陷增強了TLR3/4介導(dǎo)的體內(nèi)反應(yīng)

????????作者接下來研究了USP19在調(diào)節(jié)TLR3/4介導(dǎo)的體內(nèi)先天免疫和炎癥反應(yīng)中的功能。Usp19+/+和Usp19-/-小鼠腹腔注射聚（I:C）加D-半乳糖胺或LPS。與Usp19+/+小鼠相比，聚(I:C)-和LPS誘導(dǎo)的IFN-β、TNF、IL-6和CXCL10的產(chǎn)生在Usp19-/-的血清中顯著增加。蘇木精-伊紅（HE）染色分析表明，在注射聚（I：C）加D半乳糖胺或LPS后，在Usp19-/-小鼠的肺部觀察到更嚴(yán)重的炎癥。與USP19+/+小鼠相比，Usp19-/-小鼠更容易受誘導(dǎo)的炎癥性死亡的影響。施用鼠傷寒沙門氏菌后，Usp19-/-小鼠的肝臟和脾臟攜帶的細菌少于Usp19+/+同窩小鼠。這些結(jié)果表明，與野生型小鼠相比，Usp19-/-小鼠清除鼠傷寒沙門氏菌的能力增強。此外，Usp19-/-小鼠產(chǎn)生更高水平的血清TNF和IL-6，小腸絨毛炎癥加劇和更顯著的體重減輕，并且在施用鼠傷寒沙門氏菌后更容易發(fā)生炎癥性死亡。

研究結(jié)論：USP19缺陷增強了TLR3/4介導(dǎo)的體內(nèi)先天免疫和炎癥反應(yīng)。

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3.USP19從TRIF中去除了K27連接的多聚泛素部分

????????作者接下來確定了調(diào)控USP19對TLR3/4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的抑制作用的分子機制。報告基因檢測表明USP19抑制由TRIF過表達介導(dǎo)的ISRE激活，但不抑制TBK1或IRF3。USP19與TRIF相互作用，但不與哺乳動物過表達系統(tǒng)中的TLR3、TLR4、TRAM、MyD88或TBK1相互作用。域映射實驗表明，TRIF的TIR（aa348-580）和C端域（aa532-712）可以獨立地與USP19相互作用。另一方面，USP19的C端USP而不是N端串聯(lián)CHORD-SGT1（CS）結(jié)構(gòu)域具有與TRIF相互作用的能力。一致地，缺乏USP結(jié)構(gòu)域的USP19突變體也失去了抑制聚（I：C）和LPS觸發(fā)的IFN-β啟動子激活的能力。內(nèi)源性USP19與未刺激細胞中的TRIF相關(guān)，并且它們的關(guān)聯(lián)在poly(I:C)或LPS刺激后增加。這些結(jié)果表明USP19在TRIF水平上起作用。

????????由于USP19是一種去泛素化酶，作者接下來確定它是否去泛素化TRIF。作者發(fā)現(xiàn)USP19的過表達而不是其酶失活突變體USP19（C607S）從TRIF中去除了多聚泛素部分。相反，在Usp19-/-中增加了TRIF的多泛素化。這些數(shù)據(jù)表明USP19通過去泛素化TRIF發(fā)揮作用。作者接下來確定了USP19去除的TRIF泛素鏈的類型。通過將TRIF與僅包含單個賴氨酸殘基(KO)的泛素突變體共轉(zhuǎn)染，作者發(fā)現(xiàn)USP19從TRIF中去除了K27連接的多聚泛素部分。通過將TRIF與泛素突變體共轉(zhuǎn)染，作者發(fā)現(xiàn)USP19僅當(dāng)K27突變?yōu)榫彼釙r才能從TRIF中去除多聚泛素部分。這些結(jié)果表明USP19使來自TRIF的K27連接的多泛素部分去泛素化。一致地，與在poly(I:C)或LPS刺激后的USP19+/+細胞相比，在USP19-/-中TRIF的K27連接的多泛素化顯著增加。

研究結(jié)論：在TLR3/4激活后，USP19特異性地從TRIF中去除了K27連接的多聚泛素部分。

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4.TRIF的去泛素化會影響其向TLR3/4的募集

????????作者接下來確定了USP19介導(dǎo)的TRIF去泛素化如何損害TLR3/4信號傳導(dǎo)。在哺乳動物過表達系統(tǒng)中，USP19破壞了TRIF和TLR3之間的相互作用，但對TRIF和TBK1或TRAF3之間的相互作用沒有顯著影響。在類似的實驗中，USP19(C607S)對TRIF-TLR3和TRIFTBK1相互作用沒有顯著影響。內(nèi)源性共免疫沉淀實驗表明，在聚（I:C）刺激后，更多的TRIF被募集到USP19缺陷的293-TLR3細胞中的TLR3。這些結(jié)果表明，在TLR3激活后，USP19以去泛素化酶活性依賴的方式削弱了TRIF與TLR3的關(guān)聯(lián)。

????????在免疫和炎癥反應(yīng)中，作者試圖確定介導(dǎo)K27連接的TRIF多泛素化的E3泛素連接酶。作者通過報告基因檢測篩選了八種候選物，它們具有增強聚（I：C）觸發(fā)和TRIF介導(dǎo)的IFN-β啟動子激活的能力。隨后作者敲除293-TLR3細胞中的這些候選蛋白。作者發(fā)現(xiàn)KCTD10、HERC4、RNF13或RNF72的缺陷顯著抑制了poly(I:C)觸發(fā)的IFNB1基因轉(zhuǎn)錄。在哺乳動物過表達系統(tǒng)中，KCTD10強烈介導(dǎo)K27連接的TRIF多泛素化。內(nèi)源性免疫共沉淀實驗表明KCTD10與未刺激細胞中的TRIF相關(guān)。此外，與對照細胞相比，在KCTD10缺陷細胞中，poly(I:C)-和LPS誘導(dǎo)的K27連接的TRIF多泛素化顯著降低。KCTD10是Cullin-3-Rbx1-KCTD10RINGE3連接酶復(fù)合體中的底物特異性接頭。一致地，KCTD10介導(dǎo)的K27連接的TRIF多泛素化在Cullin3和Rbx1缺陷細胞中被消除，表明KCTD10介導(dǎo)的TRIF多泛素化依賴于Cullin-3和Rbx1。

研究結(jié)論：Cullin-3-Rbx1-KCTD10E3泛素連接酶復(fù)合物通過催化TRIF的K27-連接的多泛素化來介導(dǎo)TLR3/4介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。

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5.TRIF的Lys523被K27連接的多泛素化修飾

????????作者進行了系統(tǒng)的賴氨酸(K)到精氨酸(R)突變掃描，并在報告基因檢測中測試了USP19對其ISRE激活的影響。USP19顯著抑制由野生型和所有測試的TRIF突變體介導(dǎo)的ISRE激活，但TRIF（K523R）除外。在這些實驗中，作者還注意到與野生型和其他檢查的突變體相比，TRIF（K523R）激活I(lǐng)SRE的能力顯著降低。作者通過將TRIF(K523R)重組為缺乏TRIF的293-TLR3細胞，進一步研究了TRIF(K523R)的功能。作者發(fā)現(xiàn)與野生型TRIF和TRIF(K529R)相比，TRIF(K523R)部分失去了介導(dǎo)poly(I:C)觸發(fā)的下游IFNB1和CXCL10基因誘導(dǎo)的能力。進一步的實驗表明K523消除了其K27連接的多泛素化。在類似的實驗中，TRIF的K63連接的多泛素化在野生型TRIF與其K523R、K415R和K529R突變體之間具有可比性。此外，KCTD10催化野生型TRIF和TRIF（K529R）而不是TRIF（K523R）的K27連接的多泛素化。

研究結(jié)論：Cullin-3-Rbx1-KCTD10E3連接酶在K523處催化K27連接的TRIF多泛素化。

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結(jié)論與討論

????????在這項研究中，作者將USP19鑒定為TLR3/4信號傳導(dǎo)的負調(diào)節(jié)因子?；蚯贸芯勘砻? USP19在細胞和小鼠中負向調(diào)節(jié)TLR3/4介導(dǎo)的先天免疫和炎癥反應(yīng)。生化研究表明, USP19在TLR3/4激活后特異性去除TRIF的K27連接的多泛素部分，其缺陷會抑制TLR3/4介導(dǎo)的先天免疫信號傳導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)表明,TRIF的K27連接的多泛素化調(diào)控是TLR3/4介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機制，其在微調(diào)TRIF介導(dǎo)的先天免疫和炎癥反應(yīng)方面具有重要功能。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-12145-1