非酒精性脂肪肝病

非酒精性脂肪肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）是指除酒精和其他明確的肝損害因素所致的，以肝臟脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征。包括非酒精性脂肪肝（也稱單純性脂肪肝）、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝細胞癌，是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性損傷，與肥胖、糖尿病、高血壓、高膽固醇和代謝綜合征等代謝性疾病高度相關(guān)。NAFLD通常以膽汁酸（Bile acid，BA）穩(wěn)態(tài)破壞為特征，然而，某些BA在NAFLD中的確切作用還知之甚少。豬去氧膽酸（Hyodeoxycholic acid, HDCA）是豬膽中一類重要的膽汁酸，已經(jīng)被證實具有降低膽固醇和改善糖穩(wěn)態(tài)的作用，但是在NAFLD中的作用還未被報道。

2023年9月6日，上海中醫(yī)藥大學中藥學院李后開、盛麗莉聯(lián)合曙光醫(yī)院胡義揚及中國科學院上海藥物研究所謝岑課題組在《Nature Communications》（IF=16.6/Q1）雜志上發(fā)表了名為“Hyodeoxycholic acid ameliorates nonalcoholic fatty liver disease by inhibiting RAN-mediated PPARα nucleus-cytoplasm shuttling”的研究論文，該研究揭示了HDCA通過直接與RAN蛋白相互作用來促進PPARα的核定位，進而靶向抑制RAN/CRM1/PPARα異源三聚體的形成，從而治療NAFLD的新機制。

值得注意的是，在本研究中，作者使用了漢恒生物提供的AAV2/8-TBG-Cre和AAV2/8-TBG-ZsGreen病毒，成功獲得了肝組織特異性PPARα敲除的小鼠。

在此項研究中，作者利用靶向代謝組學檢測了健康人和NAFLD患者血清膽汁酸譜（HDCA、GHDCA、HCA、GHCA、THCA），發(fā)現(xiàn)NAFLD患者血清中HCA類膽汁酸（HDCA、GHCA、THCA）水平顯著低于健康對照人群，且HDCA和GHCA水平與NAFLD臨床指征顯著負相關(guān)。此外，作者通過高脂高糖飼養(yǎng)獲得NAFLD小鼠，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAFLD小鼠血清、肝臟和不同腸內(nèi)容物中HCA類膽汁酸水平顯著低于健康小鼠，并且HDCA在NAFLD小鼠血清和NAFLD患者血清中含量保持一致性，均低于正常對照。另外，研究發(fā)現(xiàn)血清HDCA的水平與肝臟重量、肝臟甘油三酯(TG)、血清 ALT 和 AST 呈負相關(guān)，由此表明，在人和小鼠中，血清HDCA水平與肝脂肪變性成負相關(guān)，提示膳食補充 HDCA 可能對NAFLD 具有保護作用。

圖1 NAFLD患者和飲食誘導的NAFLD小鼠血清HDCA水平降低

為了探究HDCA是否能改善NAFLD，作者，在NAFLD小鼠的飲食中添加HDCA，發(fā)現(xiàn)HDCA能夠減輕NAFLD小鼠體重、肝臟重量、肝臟脂肪變性、炎癥評分以及NAFLD活動度評分（NAS），但是，并不影響小鼠總能量的攝入。此外，飲食中補充HDCA也降低了NAFLD小鼠肝臟TG，血清ALT和AST水平，并逆轉(zhuǎn)了由飲食誘導的肝臟炎癥因子的高表達及改善了NAFLD小鼠體內(nèi)的葡萄糖平穩(wěn)態(tài)。由此表明，飲食中添加HDCA可以顯著改善NAFLD及各種代謝異常。

圖2 補充HDCA改善NAFLD

為了進一步探究HDCA改善NAFLD的作用機制，作者利用串聯(lián)質(zhì)譜分析了小鼠肝組織的蛋白質(zhì)組學特征。對照組（正常小鼠）和模型組（NAFLD小鼠）中共篩選到1190個差異蛋白質(zhì)，模型組和治療組（HDCA處理）中共篩選到623個差異蛋白質(zhì)（P<0.05,大于1.2倍），有430個差異蛋白重疊，其中420個蛋白的表達被HDCA逆轉(zhuǎn)。對420個差異蛋白進行KEGG分析，差異蛋白主要富集在代謝、氧化磷酸化、NAFLD和PPAR信號通路中，與肝臟脂肪酸代謝密切相關(guān)。脂肪酸代謝相關(guān)蛋白熱圖顯示，大多數(shù)脂肪酸氧化（Fatty acid oxidation，F(xiàn)AO）相關(guān)蛋白在模型組組中表達下調(diào)，在治療組中表達上調(diào)。

接著，作者對小鼠肝組織進行了轉(zhuǎn)錄組學分析，在對照組和模型組中共篩選到2039個差異基因，模型組和治療組中共篩選到1121個差異基因（P<0.05,大于2倍）；有769個差異基因重疊，其中762個基因的表達被HDCA逆轉(zhuǎn)。對762個差異基因進行KEGG和GSEA分析，KEGG分析顯示差異基因主要富集在視黃醇代謝、類固醇激素合成、脂肪酸降解以及PPAR信號通路；GSEA分析顯示HDCA組（治療組）中差異基因主要富集在FAO和PPARα靶基因。另外，研究結(jié)果顯示，HDCA顯著抑制脂肪酸攝取蛋白CD36的表達，但激活了細胞內(nèi)脂肪酸結(jié)合蛋白1（FABP1）和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶2（CPT2）的表達，導致脂肪酸向線粒體的運輸增加；此外，5種關(guān)鍵的β氧化酶（ACADL、ACADVL、HADHA、HADHB和ACAA2）在HDFA干預后表達均上調(diào)，以及酮生成的限速酶HMGCS2的表達也被HDFA促進；由此推測，HDFA的抗NAFLD作用主要與活化肝細胞脂肪酸氧化信號通路有關(guān)。

圖3 HDCA激活肝細胞脂肪酸氧化

PPARα是脂肪酸氧化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，觸發(fā)核內(nèi)脂肪酸氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。WB檢測結(jié)果顯示HDCA攝取不影響PPARα蛋白的總含量，但是能夠促進PPARα的入核；而模型組中PPARα蛋白的入核被抑制；同時，與蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)一致，HDCA組中PPARα靶標蛋白如FABP1、CPT2和HMGCS2的蛋白表達顯著升高，CD36的表達顯著降低。此外，HDCA能夠減輕炎癥。為了進一步探究HDCA能否直接調(diào)控PPARα的核定位，作者用2種不同劑量的HDCA處理AML12細胞，研究結(jié)果顯示，HDCA呈劑量依賴性的調(diào)節(jié)PPARα的入核，同時促進了CPT1、CPT2以及FABP1的表達，但是不影響PPARα的總表達量。與此同時，HDCA降低了AML12細胞和RAW264.7細胞中趨化因子和細胞因子的表達，這表明HDCA具有抗炎作用；綜上表明HDCA能促進PPARα的核定位，并且通過激活PPARα介導脂肪酸氧化和抑制炎癥。

圖4 HDCA促進PPARα的核定位和PPARα靶基因的表達

接著，作者構(gòu)建了PPARα敲除小鼠進一步探究HDCA的抗NAFLD保護作用是否依賴于PPARα。與野生NAFLD小鼠比較，HDCA干預未能改善PPARα-/-小鼠的NAFLD相關(guān)指標，如體重、肝臟TG、肝臟脂肪變性評分和NAS；并且HDCA沒有改變PPARα-/-小鼠體內(nèi)FABP1、CPT2和HMGCS2的表達以及肝臟炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的水平。為了進一步確認HDCA抗NAFLD的保護作用依賴于肝臟PPARα，作者通過在PPARαfloxp/floxp小鼠體內(nèi)注射AAV2/8-TBG-Cre病毒，構(gòu)建了肝臟特異性PPARα敲除的小鼠；與PPARα全身敲除小鼠的研究結(jié)果相似，HDCA干預未能改善PPARα肝臟特異性敲除的小鼠的NAFLD相關(guān)指標以及相關(guān)基因的表達；由此提示HDCA的抗NAFLD作用依賴于肝臟PPARα的表達。

圖5 PPARα缺陷消除HDCA介導的抗NAFLD作用

法尼酯X受體(Farnesoid X receptor, FXR)是全身能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，F(xiàn)XR-SHP通路是肝臟調(diào)節(jié)膽汁代謝的關(guān)鍵通路。雙熒光素酶結(jié)果顯示，HDCA能夠輕度激活HEK293T細胞中FXR的轉(zhuǎn)錄活性；此外，HDCA能促進AML12細胞中SHP基因的表達；但是，F(xiàn)XR拮抗劑并不影響HDCA對PPARα的核定位以及PPARα靶基因的促進作用。由此表明，HDCA對PPARα的作用并不依賴于FXR。之后，作者通過在細胞中加入異丙硝唑（IPZ）阻斷了PPARα的核輸入，導致細胞質(zhì)中PPARα的積累，而在IPZ存在的情況下，HDCA仍然能夠促進核PPARα的積累，但是在細胞中加入萊普霉素B（LMB）（一種出核轉(zhuǎn)運抑制劑）后，HDCA不能促進核PPARα的積累，由此表明，HDCA主要是通過抑制PPARα的出核而不是入核影響PPARα的核定位。此外，HDCA能顯著增加細胞核中出核受體CRM1的表達，而降低細胞質(zhì)中CRM1的表達（細胞內(nèi)總量不發(fā)生變化），這一實驗結(jié)果也在體內(nèi)水平得到驗證。以上實驗結(jié)果表明，HDCA通過抑制CRM1介導的核輸出過程來促進PPARα的核定位。

圖6 HDCA以不依賴FXR的方式抑制PPARα的核輸出

為了探究HDCA介導的PPARα核積累的分子機制，作者利用蛋白質(zhì)組學篩選了參與核轉(zhuǎn)運與HDCA結(jié)合的潛在蛋白質(zhì)，篩選結(jié)果顯示HDCA與RAN結(jié)合，而不是與CRM1和PPARα結(jié)合；接著，作者通過細胞熱轉(zhuǎn)移實驗（CETSA）證實了HDCA與RAN的直接相互作用；之后作者利用免疫共沉淀、鄰位連接技術(shù)以及分子對接等技術(shù)對HDCA/RAN/CRM1/PPARα四者之間的關(guān)系進行了驗證，實驗結(jié)果顯示HDCA通過與肝細胞內(nèi)RAN蛋白（屬于小G蛋白家族）結(jié)合，進而干擾RAN和出核轉(zhuǎn)運蛋白CRM1的結(jié)合，從而抑制RAN/CRM1/PPARα異三聚體的形成，抑制PPARα出核，增加肝細胞核內(nèi)PPARα蛋白含量。

圖7 HDCA直接與RAN結(jié)合以抑制RAN/CRM1/PPARα輸出異三聚體的形成

綜上所述，該研究闡明了HDCA抵抗NAFLD的分子機制，即HDCA進入肝細胞后通過與RAN蛋白直接結(jié)合，抑制RAN/CRM1/PPARα異源三聚體的形成，導致核內(nèi)PPARα的積累。這提示HDCA是一種有前景的NAFLD治療藥物，并且通過靶向PPARα的核定位為對抗NAFLD提供了一種治療策略。

圖8 作用機制模式圖