有一篇Nature綜述提供了TLS相關(guān)的基因集合：

39個TLSs特征基因包括：CCL2/3/4/5/8/18/19/21、CXCL9/10/11/13為趨化因子標(biāo)記基因；CXCL13、CD200、FBLN7、ICOS、SGPP2、SH2D1A、TIGIT、PDCD1為T濾泡輔助細胞(Tfh細胞)的特征基因；CD4、CCR5、CXCR3、CSF2、IGSF6、IL2RA、CD38、CD40、CD5、MS4A1、SDC1、GFI1、IL1R1、IL1R2、IL10、CCL20、IRF4、TRAF6、STAT5A為TH1細胞和B細胞標(biāo)記基因；TNFRSF17是漿細胞標(biāo)記基因。

既然已經(jīng)有現(xiàn)成的基因集合了，那么就可以直接拿來做生信分析啦！

接下來番茄君給大家分享一個疾病分型+二次聚類+TLS評分的純生信分析思路~

題目：三級淋巴結(jié)構(gòu)模式有助于膀胱癌腫瘤微環(huán)境浸潤的識別和治療藥物的選擇

雜志：Frontiers in immunology

影響因子：8.786

發(fā)表時間：2022年11月

研究思路

從TCGA、GEO、ArratyExpress和IMvigor210下載18個膀胱癌(BCa)數(shù)據(jù)集。基于39個TLS特征基因(TSGs)評估所有患者的TLS模式，并將TLS模式與預(yù)后和腫瘤微環(huán)境(TME)細胞浸潤特征進行了相關(guān)性分析。使用cox回歸模型和主成分分析(PCA)算法構(gòu)建TLS評分，分析TLS評分預(yù)測預(yù)后、免疫治療和化療反應(yīng)的作用。

主要結(jié)果

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1.?BCa中TLS特征基因(TSGs)分析

分析BCa中39個TSGs的體細胞突變和拷貝數(shù)變異(CNV)的發(fā)生率。發(fā)現(xiàn)這些基因在BCa中的突變率較低，而所有TSGs中CNV均有改變。然后使用Combat算法消除18個數(shù)據(jù)集的批效應(yīng)，并將其合并為一個新的隊列。在處理前，這些數(shù)據(jù)集可以很容易地通過主成分分析(PCA)進行區(qū)分(圖D)，而處理后的數(shù)據(jù)集融合良好(圖E)。

圖1. BCa中TLS特征基因的遺傳變異及18個數(shù)據(jù)集的組合

2.?聚類分析TLS模式和腫瘤微環(huán)境（TME）細胞浸潤特征

采用非負矩陣分解(NMF)算法進行聚類，分為5個TLS模式，稱為TLS亞群C1-C5。分析五種TLS模式的免疫細胞浸潤是否存在顯著差異，進行了TME浸潤分析。TME細胞浸潤特征與生存分析結(jié)果一致，C1和C2組患者與其他組相比具有明顯的生存優(yōu)勢。進一步分析了5個TLS模式中的TSGs特征，發(fā)現(xiàn)5個亞群中25個TSGs轉(zhuǎn)錄譜的顯著差異。

圖2. 聚類分析和免疫細胞浸潤分析

3.?基于5個TLS亞群間的差異表達基因（DEGs）進行二次聚類

Limma分析出77個與TLS亞群相關(guān)的DEGs。Cox回歸模型篩選出33個有預(yù)后價值的DEGs，對DEGs進行GO和KEGG富集分析，這些DEGs在免疫細胞活化、細胞因子受體反應(yīng)和T細胞信號通路高度富集，再次證明TLSs在TME的調(diào)節(jié)中起重要作用。然后，采用無監(jiān)督聚類算法對這33個TLS相關(guān)DEGs進行聚類分析，將患者分為4個基因組亞組，命名為基因Cluster?A-D。

同樣，分析了這四個基因Cluster在TME細胞浸潤方面的差異，發(fā)現(xiàn)與TLS模式相似的浸潤特征。生存分析顯示，基因Cluster?A的患者比基因Cluster?B-D的患者預(yù)后好。然后分析了這五個基因Cluster中TSGs的表達水平。

圖3. TLS基因的二次聚類、免疫浸潤和預(yù)后分析

4.?構(gòu)建TLS評分

構(gòu)建一個評分系統(tǒng)（TLS評分）來量化TLS模式，并根據(jù)該評分將患者分為TLS高評分組和TLS低評分組。使用基因集富集分析(GSEA)來研究TLS高評分組和TLS低評分組之間的差異活性通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低TLS評分組主要富集于免疫應(yīng)答相關(guān)通路，而高TLS評分組代謝相關(guān)通路和細胞生長分化相關(guān)通路富集。在元隊列和IMvigor210免疫治療隊列中，TLS評分低的患者具有顯著的生存優(yōu)勢。TLS評分與TMB之間沒有顯著的相關(guān)性，結(jié)合TLS評分和TMB來預(yù)測預(yù)后，發(fā)現(xiàn)高TMB和低TLS評分的患者總生存期最好，低TMB和高TLS評分的患者總生存期最差。

5.?TLS評分和TME細胞浸潤

使用TIMER、CIBERSORT、CIBERSORT- abs、QUANTISEQ、MCPCOUNTER、XCELL和EPIC等9種算法對兩個TLS評分組的TME免疫細胞浸潤特征進行分析。發(fā)現(xiàn)TLS評分低組免疫評分和ESTIMATE評分較高。ssGSEA顯示了兩組免疫功能的差異，發(fā)現(xiàn)低評分組在除IFN-γ反應(yīng)外的幾乎所有抗腫瘤過程中免疫功能都更好。

圖5. TLS評分高組和低組TME細胞浸潤特征

分析TLS評分與免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)TLS評分與大多數(shù)免疫細胞浸潤水平呈顯著負相關(guān)。

圖6. TLS評分與免疫細胞的線性回歸分析

6.?TLS評分在免疫治療和化療中的作用

上述結(jié)果表明，TLS評分是預(yù)測預(yù)后的良好指標(biāo)，且與免疫細胞浸潤水平密切相關(guān)。推測TLS評分低可能代表對免疫治療更敏感的免疫亞型。因此，分析TLS評分與ICB治療反應(yīng)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)較低的TLS評分與抗PD-1免疫治療的更好反應(yīng)顯著相關(guān)。

然后，根據(jù)抗PD-L1和抗CTLA-4治療的使用情況，將患者分為四個亞組:CTLA-4陽性PD-1陽性、CTLA-4陽性PD-1陰性、CTLA-4陰性PD-1陽性、CTLA-4陰性PD-1陰性。在四個亞組中，低TLS評分組的IPS評分均顯著高于低TLS評分組，這表明低TLS評分組的患者與高TLS評分組相比，抗PD -1、抗CTLA -4或聯(lián)合免疫治療的反應(yīng)更好。

腫瘤免疫功能障礙和排除(Tumor Immune Dysfunction and Exclusion, TIDE)分析發(fā)現(xiàn)低TLS評分與高TIDE評分相關(guān)，這種免疫逃避效應(yīng)可能是由于低TLS評分組Treg浸潤水平較高所致。

此外，還分析了TLS評分與化療反應(yīng)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TLS評分低與吉西他濱、順鉑、長春堿、表柔比星敏感性評分低顯著相關(guān)，提示TLS評分低組對化療的敏感性較高。

圖7. TLS模式在免疫治療和化療中的作用

總結(jié)

這篇文章就是以TLSs為切入點進行分析，進行疾病分型，先根據(jù)TLS特征基因進行聚類，再根據(jù)5個TLS亞組間的DEGs進行二次聚類。最后構(gòu)建了TLS評分，分析思路并不復(fù)雜，就因為分析了TLSs使得純生信文章1個月就接收！輕松拿下8分+，性價比高得讓人心動~

目前，利用TLS相關(guān)基因做生信分析的文章還比較少，選對生信切入點，輕松發(fā)文不是夢~感興趣的小伙伴趕快行動起來吧！想定制創(chuàng)新性思路歡迎直接call番茄君哦，下一篇生信文章在向你招手！