一、數(shù)據(jù)采集及顯示

將前向散射光檢測(cè)器、側(cè)向散射光檢測(cè)器及熒光檢測(cè)器收集的光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電壓脈沖后，再通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成為計(jì)算機(jī)能夠儲(chǔ)存處理的數(shù)字信號(hào)。流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)以FSC標(biāo)準(zhǔn)格式存儲(chǔ)，該標(biāo)準(zhǔn)由“分析細(xì)胞學(xué)協(xié)會(huì)”制定。根據(jù)FSC標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)格式應(yīng)包括三個(gè)文件：樣本獲取文件，數(shù)據(jù)設(shè)置文件和數(shù)據(jù)分析結(jié)果。

數(shù)據(jù)采集存儲(chǔ)完畢后，細(xì)胞亞群可以幾種不同格式顯示。單參數(shù)如FSC或FITC（FL1）可使用直方圖，橫軸表示熒光通道，縱軸表示在該通道內(nèi)收集到的細(xì)胞數(shù)量（如圖1）。處在同一通道的每一細(xì)胞符合該通道的信號(hào)值，而且具有相同的信號(hào)密度。通道右側(cè)信號(hào)的熒光強(qiáng)度明顯高于左側(cè)，越靠右側(cè)熒光亮度越強(qiáng)。雙參數(shù)可在二維散點(diǎn)圖中同時(shí)顯示，X軸顯示通道1（FL1），Y軸顯示通道2（FL2）。三維圖通過X，Y，Z三個(gè)軸分別顯示每個(gè)通道的細(xì)胞量（如圖1）。

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二、設(shè)門

通過設(shè)門的方法可以定義細(xì)胞亞群的區(qū)域（如圖2）。如，血樣本是混合細(xì)胞群，如果想單獨(dú)分析淋巴球細(xì)胞，可根據(jù)FSC或細(xì)胞大小，在FSC，SSC的散點(diǎn)圖中設(shè)門，其數(shù)據(jù)結(jié)果只反映淋巴細(xì)胞亞群的熒光特性。

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圖2 全血樣本中淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)據(jù)分析圖

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三、細(xì)胞亞群的數(shù)據(jù)分析

門內(nèi)細(xì)胞亞群的數(shù)據(jù)結(jié)果可在隨后的圖中顯示。我們可以通過單參數(shù)直方圖，二維點(diǎn)圖和三維圖來分析結(jié)果。單參數(shù)直方圖可定位邊界，二維點(diǎn)圖可設(shè)置象限標(biāo)志。如果需要，還可以建立數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表以輸出結(jié)果。

直方圖可直觀的顯示單個(gè)參數(shù)的細(xì)胞數(shù)量。陰性對(duì)照用于決定直方圖中單參數(shù)的左右邊界（如圖3）。

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圖3?陰性對(duì)照峰M1（NORM001）和CD3 FITC陽性峰（NORM002）

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圖4的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，整個(gè)事件共記錄了6000個(gè)細(xì)胞，門內(nèi)淋巴細(xì)胞2891個(gè)。其中M1（陰性）細(xì)胞為619個(gè)，M2（CD3陽性）細(xì)胞為2272個(gè)。淋巴細(xì)胞亞群CD3陽性百分含量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果為，M2：Gated = 2272/2891 = 78.59%

二維散點(diǎn)圖以雙參數(shù)顯示結(jié)果，每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。圖5左圖為陰性對(duì)照?qǐng)D，用于設(shè)定陰性對(duì)照邊界，將全圖劃分為四個(gè)象限，以區(qū)分陰性細(xì)胞、單陽性細(xì)胞及雙陽性細(xì)胞。左下象限（Lower left，LL）為雙陰性細(xì)胞，左上象限（Upper left，UL）為Y軸陽性細(xì)胞（CD19 PE），右下象限（Lower right，LR）為X軸陽性細(xì)胞（CD3 FITC），右上象限（Upper right，UR）為雙陽性細(xì)胞（CD19+/CD3+）。

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圖5?陰性對(duì)照組（NORM001）和CD3 FITC/CD19 PE雙染樣本（NORM002）?

圖6?二維散點(diǎn)圖統(tǒng)計(jì)結(jié)果

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如圖6所示，淋巴細(xì)胞亞群雙陽性細(xì)胞（CD19+/CD3+）的百分含量為：296/2839 = 10.43%

除了劃定象限，分析細(xì)胞亞群散點(diǎn)圖的另一個(gè)方法是劃定區(qū)域，也就是設(shè)門，即在門中在設(shè)門。我們可以用不同形狀的繪圖工具定義所選區(qū)域（如圖7）；然后統(tǒng)計(jì)該區(qū)域內(nèi)指定細(xì)胞亞群的百分含量。在圖8中，R4門內(nèi)為CD4+，CD3-的淋巴細(xì)胞亞群，其結(jié)果為：40/2866 = 1.40%

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圖7?CD3 FITC/CD4 PE雙染樣本分析圖

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圖8?CD3 FITC/CD4 PE雙染樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

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這種門內(nèi)設(shè)門的方法在分析不同的供體細(xì)胞時(shí)存在一個(gè)缺陷，因?yàn)槿绻孪榷x好細(xì)胞亞群的區(qū)域或邊界，在隨后的文件中，下一個(gè)樣本的細(xì)胞亞群位置會(huì)發(fā)生變化，這就需要操作者重新調(diào)整區(qū)域或邊界位置。為避免這種情況的發(fā)生，可以采用一種稱為集群分析（cluster analysis）的新方法。該方法的特點(diǎn)是會(huì)隨著整個(gè)細(xì)胞亞群的移動(dòng)而移動(dòng)，自動(dòng)變換區(qū)域或邊界到相應(yīng)的細(xì)胞亞群位置（如圖9）。

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圖9?使用Attractors分析軟件時(shí)二維點(diǎn)圖的前后變化比較

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四、流式細(xì)胞儀的其他數(shù)據(jù)分析

上面提到的這些分析方法通常適用于計(jì)算離散細(xì)胞群的百分含量，對(duì)于分析單克隆細(xì)胞株分子是否呈陽性并不適用。因?yàn)閱慰寺〖?xì)胞株是單個(gè)細(xì)胞群，在大多數(shù)情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽性，所以我們通過幾何均值法和中位法統(tǒng)計(jì)細(xì)胞熒光密度和陽性率。如果樣本的統(tǒng)計(jì)結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陰性對(duì)照組，那么我們認(rèn)為其結(jié)果是陽性的，兩者間的差異越大，說明細(xì)胞的表達(dá)越高，陽性率越高。如圖10所示，左圖為單細(xì)胞群的散射光信號(hào)，右圖為陰性對(duì)照組和兩種不同抗體染色樣本的峰疊加圖。每個(gè)峰的幾何均值分別為2，5和20（從左至右）。

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圖10?單細(xì)胞株分析圖

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除檢測(cè)陽性率，幾何均值法和中位法還用于分子（接合子）定量分析。QuantiCALCTM軟件就是使用中值法計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的抗體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。如圖11所示，Y軸上的圓圈代表從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲取的信息，用于計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的接合點(diǎn)位數(shù)。

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圖11?QuantiCALC分析每個(gè)細(xì)胞的抗體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

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此外，可以使用ModFit LTTM軟件進(jìn)行DNA定量分析。因?yàn)镈NA峰（G0/G1期，S期和G2，M期）不是離散的，所以一般對(duì)曲線以下的面積進(jìn)行積分，以得到每個(gè)細(xì)胞亞群的百分含量結(jié)果（如圖12）。

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圖12?細(xì)胞周期的DNA直方圖