?腫瘤微環(huán)境與微生物?

腫瘤的發(fā)展除了與癌細(xì)胞自身基因突變導(dǎo)致的惡性增殖有關(guān)以外，還與腫瘤微環(huán)境?(Tumor microenvironment, TME)?息息相關(guān)。在癌癥中，正常組織中和諧的細(xì)胞互作關(guān)系被破壞，原本保護(hù)正常細(xì)胞生存的微環(huán)境在腫瘤細(xì)胞的影響下，逐漸演變成適應(yīng)腫瘤生長的條件。例如正常巨噬細(xì)胞是參與免疫反應(yīng)，吞噬病原體、死亡細(xì)胞等，而腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞卻能促進(jìn)腫瘤生長、參與免疫抑制。

無處不在的微生物也存在于腫瘤微環(huán)境中。2020 年 5 月，Ravid Straussman 團(tuán)隊(duì)在 Science 上發(fā)表了一項(xiàng)大規(guī)模腫瘤微生物組的研究結(jié)果。他們采集了 1526 份不同癌癥類型患者樣品，發(fā)現(xiàn)每種腫瘤類型都有不同的微生物組組成，例如，厚壁菌門和擬桿菌門的細(xì)菌在結(jié)直腸腫瘤中數(shù)量最多，變形桿菌在胰腺癌的微生物組中占主導(dǎo)地位。他們還通過代謝組學(xué)預(yù)測了腫瘤微生物的功能與其腫瘤微環(huán)境之間存在聯(lián)系[1]。但這一研究并未證明腫瘤微生物是否在癌癥的發(fā)展中起因果作用。

今年 11 月，Susan Bullman 領(lǐng)導(dǎo)的研究小組在 Nature 上發(fā)表了一篇題為 Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer 的研究性論文。他們采用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)來鑒定癌癥患者患者腫瘤內(nèi)微生物群落及其原位位置，還開發(fā)了一種單細(xì)胞 RNA 測序方法，用于識別細(xì)胞相關(guān)細(xì)菌和它們相互作用的宿主細(xì)胞。該研究結(jié)果揭示了腫瘤微生物促進(jìn)癌癥進(jìn)展的作用[2]。

腫瘤微生物促進(jìn)癌癥進(jìn)展?

■ 腫瘤內(nèi)微生物群的異質(zhì)性

研究者們首先對?11 例結(jié)直腸癌 (colorectal cancer, CRC)?患者的 44 塊腫瘤組織進(jìn)行了 16S rRNA 基因測序，發(fā)現(xiàn)在個體患者腫瘤中瘤內(nèi)微生物門屬水平上的種類有所不同，大部分患者 (n=7/11)?的瘤內(nèi)微生物表現(xiàn)出不同程度的異質(zhì)性，即一部分患者的瘤內(nèi)微生物在組織中分布不均勻。

圖 1. 具核梭桿菌 (Fusobacterium nucleatum) 和其他細(xì)菌群落在口腔鱗狀細(xì)胞癌?(OSCC) (左) 和 CRC (右) 腫瘤組織中的空間分布[2]

具核梭桿菌探針為紅色，真細(xì)菌探針為青色；Bac- 為細(xì)菌陰性區(qū)，Bac+ 為細(xì)菌陽性區(qū)

??為了進(jìn)一步研究瘤內(nèi)微生物的分布空間和特性問題，研究者使用 10×?Visium 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)對 CRC 樣本和口腔鱗狀細(xì)胞癌 (oral squamous cell carcinoma, OSCC) 樣本進(jìn)行無偏分析，定位細(xì)菌轉(zhuǎn)錄本空間坐標(biāo)以及量化細(xì)菌轉(zhuǎn)錄量。細(xì)菌分布及載量如圖 2a 所示，此外還發(fā)現(xiàn)，微單胞菌屬?(Parvimonas)、嗜胨菌屬 (Peptoniphilus) 和梭桿菌屬 (Fusobacterium) 是 OSCC 腫瘤樣本中最主要的屬，梭桿菌屬 (Fusobacterium) 和擬桿菌屬 (Bacteroides) 是 CRC 腫瘤樣本中最主要的屬。

圖?2.?腫瘤組織中瘤內(nèi)細(xì)菌的空間分布[2]

a. OSCC 和 CRC 腫瘤樣本中細(xì)菌空間分布及轉(zhuǎn)錄量；b. OSCC 和 CRC 腫瘤樣本中不同菌屬占比

■ 腫瘤內(nèi)生態(tài)位被微生物定植

為了確定瘤內(nèi)微生物在個體腫瘤中的異質(zhì)分布是否與 TME 的功能有關(guān)，作者團(tuán)隊(duì)通過 GeoMx 數(shù)字空間分析 (digital spatial profiling, DSP) 平臺，使用靶向方法，量化了與抗腫瘤免疫和癌癥進(jìn)展相關(guān)的 77 種蛋白質(zhì)的表達(dá)譜，對所感興趣的免疫區(qū)室或上皮癌區(qū)室中的蛋白進(jìn)行分區(qū)分析?(細(xì)菌陰性區(qū) Bac-?與細(xì)菌陽性區(qū) Bac+)。在 OSCC 和 CRC 腫瘤的 CD45+?免疫區(qū)室中，細(xì)菌存在于高度免疫抑制的微生態(tài)位 (microniches)，其特征是成熟 CD66b+?骨髓細(xì)胞以及免疫抑制分子 ARG1 (精氨酸酶 1) 和免疫檢查點(diǎn)蛋白 CTLA4 (細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白 4) 的上調(diào)。此外，在兩種癌癥類型中，ERK1 和 ERK2 磷酸化水平升高，這表明骨髓對腫瘤內(nèi)細(xì)菌的反應(yīng)可能是通過激活 MAPK 信號通路發(fā)生的。在兩種癌癥類型的 PanCK+上皮腫瘤區(qū)室中，細(xì)菌定植區(qū)域 (Bac+) 的血管化程度低于細(xì)菌陰性區(qū)域 (Bac-)，平滑肌肌動蛋白 (SMA) 表達(dá)減少，增殖水平降低 (圖 3) (在連續(xù)的組織切片中，使用抗泛細(xì)胞角蛋白 (PanCK) 和CD45免疫熒光可標(biāo)記上皮癌細(xì)胞和免疫區(qū)室在腫瘤組織的分布)。在 OSCC 和 CRC 腫瘤組織的細(xì)菌定植微生態(tài)位中，腫瘤抑制因子 p53 野生型構(gòu)型的蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低，表明細(xì)菌定位與 TME 內(nèi)高度轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞相關(guān)。細(xì)菌定植的微生態(tài)位顯著增加了 CRC 腫瘤中 JNK、ERK1 和 ERK2 以及 P38 的磷酸化水平，這一通路即為在細(xì)菌響應(yīng)中被激活的信號通路。

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圖?3.?腫瘤相關(guān)微生物群對局部微生態(tài)位的影響[2]

RNascope-CISH 圖像顯示具核梭桿菌 (暗紅色) 和其他細(xì)菌群落 (青藍(lán)色) 在腫瘤組織中的分布，連續(xù)的免疫組織化學(xué)圖像顯示 CD45+ (紅色) 和 PanCK+ (綠色) 細(xì)胞的分布，以分別鑒定腫瘤組織中的免疫和上皮區(qū)室。

■ 微生物驅(qū)動的單細(xì)胞異質(zhì)性

為了研究 TME 中細(xì)菌-宿主細(xì)胞間的相互作用以及對宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的影響，作者團(tuán)隊(duì)通過引入靶向細(xì)菌 16S rRNA 保守區(qū)域的引物開發(fā)了侵襲-黏附定向表達(dá)測序法 (invasion-adhesion-directed expression sequencing, INVADEseq)。他們利用該方法檢測了 7 位 OSCC 患者的新鮮腫瘤組織。共聚焦成像結(jié)果顯示，在組織分離成單個細(xì)胞后，這些患者腫瘤的單個細(xì)胞內(nèi)含有細(xì)胞粘附細(xì)菌和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌?(圖? 4a)。這 7 份腫瘤樣本的整合 scRNA-seq 結(jié)果顯示，瘤內(nèi)微生物區(qū)系以梭桿菌屬 (Fusobacterium) (占 34%) 和密螺旋體屬 (Treponema) (29.8%) 為主 (圖 4b)。

為了確定這兩種菌屬是否影響上皮細(xì)胞的信號通路，作者團(tuán)隊(duì)將梭桿菌屬或密螺旋體屬陽性的單上皮細(xì)胞與上皮細(xì)胞簇中的細(xì)菌陰性細(xì)胞 (Total Bac-)?進(jìn)行比較。GSEA分析結(jié)果顯示，IFN 和 JAK-STAT 信號顯著上調(diào) (伴隨 SERPIN 家族分子表達(dá)增加)，趨化因子 (如 CXCL10, CXCL11, CCL4 和 CCL3) 以及金屬蛋白酶 (MMP9 和 MMP3) 也顯著上調(diào) (圖 4d-e)。另外還比較了泛細(xì)菌陽性?(Total Bac+) 與細(xì)菌陰性 (Total Bac-) 細(xì)胞之間的差異，結(jié)果顯示，與感染特定菌屬的細(xì)胞相比，泛細(xì)菌陽性上皮細(xì)胞中與癌癥進(jìn)展相關(guān)的基因表達(dá)和細(xì)胞信號通路僅受到很小程度影響。

這些結(jié)果表明，瘤內(nèi)微生物可以在免疫和上皮細(xì)胞群的單細(xì)胞水平上驅(qū)動患者腫瘤的異質(zhì)性。?

圖 4.?瘤內(nèi)細(xì)菌對宿主單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的影響[2]

a. OSCC 患者腫瘤內(nèi)細(xì)菌的分布；b. 使用 INVADEseq 方法整合 7 例 OSCC 患者的腫瘤 scRNA-seq 數(shù)據(jù)后，在屬水平上的微生物組組成。c-d. 梭桿菌屬?(Fuso) (上)?和密螺旋體屬?(Trep) (下)?陽性單上皮細(xì)胞與陰性細(xì)胞?(Total Bac-)?的 GSEA 分析結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞之間信號通路與基因表達(dá)有顯著差異?(NES：normalized enrichment scores 歸一化富集分?jǐn)?shù))

■ 瘤內(nèi)微生物誘導(dǎo)癌細(xì)胞遷移

作者團(tuán)隊(duì)還探究了腫瘤內(nèi)微生物群的主要菌屬與免疫或上皮癌細(xì)胞的直接相互作用。他們將 CRC 上皮球狀體與從 CRC 分離的具核梭桿菌共培養(yǎng)，然后包埋到含有均勻分布中性粒細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)中 (圖 5a)。通過活細(xì)胞共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，在沒有具核梭桿菌的情況下，中性粒細(xì)胞在上皮球狀體內(nèi)自由遷移 (平均速度為 4.329 μm·min-1?±?0.08766 (s.e.m.)，平均細(xì)胞位移為 57.21 μm)。在有具核梭桿菌的情況下，中性粒細(xì)胞通過降低其遷移能力來應(yīng)對細(xì)菌感染 (平均速度為 3.593 μm·min-1?±?0.08561 (s.e.m.)，平均細(xì)胞位移為 34.53 μm)。中性粒細(xì)胞簇的形成伴隨著 ERK 和p38 MAPK 磷酸化水平的顯著增加。其部分原因是髓系對瘤內(nèi)細(xì)菌的反應(yīng)。另外，作者團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，感染具核梭桿菌的 ?CRC 上皮細(xì)胞從球狀體脫離，并作為單個上皮細(xì)胞遷移到周圍的膠原蛋白基質(zhì)中 (圖 5b)。進(jìn)入基質(zhì)的被感染癌細(xì)胞以平均速度為 19.99?μm·h-1?±?0.827?(s.e.m.) 的速率遷移。

這些結(jié)果表明，入侵癌細(xì)胞的細(xì)菌不僅促進(jìn)了癌細(xì)胞在膠原基質(zhì)中的擴(kuò)散，而且還改變了受感染癌細(xì)胞的運(yùn)動模式，從而在功能水平上促進(jìn)了細(xì)胞的異質(zhì)性。

圖?5.?具核梭桿菌誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集和癌細(xì)胞上皮細(xì)胞遷移[2]

a. 活細(xì)胞共聚焦成像顯示，在沒有 (左) 或有 (右) 具核梭桿菌的情況下，與 CRC 球體相關(guān)的中性粒細(xì)胞運(yùn)動狀態(tài)；b. 共聚焦顯微鏡觀察在沒有 (左) 和有具核梭桿菌 (右) 的情況下 HCT116 細(xì)胞球體入侵膠原基質(zhì)的狀態(tài)。

總結(jié)?

基于基因組學(xué)的研究表明，大多數(shù)主要類型的人類癌癥都含有瘤內(nèi)微生物。這些微生物群落因癌癥類型而異，特定細(xì)菌可促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展。作者團(tuán)隊(duì)使用了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)、scRNA-seq 技術(shù)以及自主開發(fā)的 INVADEseq 技術(shù)，揭示了腫瘤微生物如何導(dǎo)致了腫瘤的異質(zhì)性以及與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系。該研究結(jié)果表明，腫瘤微生物是腫瘤微環(huán)境的一個基本組成部分，可以改變不同細(xì)胞區(qū)室的基因表達(dá)及信號通路，能夠影響抗腫瘤免疫和癌癥上皮細(xì)胞的遷移。這一研究可為癌癥的治療提供新思路。

參考文獻(xiàn)

1. Nejman D, Straussman R, et al. The human tumor microbiome is composed of tumor type-specific intracellular bacteria. Science. 2020 May 29;368(6494):973-980.

2. Galeano Ni?o JL, Bullman S, et al. Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer. Nature. 2022 Nov;611(7937):810-817.